针刺“百会”透“曲鬓”穴对急性脑出血大鼠血肿及CD36、HO-1表达的影响*

陈秋欣,孔 莹,于婷婷,张 瑜,刘 鹏,张 鑫,朱路文△

1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；3.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001；4.深圳市宝安中医院(集团)，广东 深圳 518133

脑出血(Intracerebral hemorrhage,ICH)指非外伤性脑实质内出血，具有极高的致残率、致死率[1]。据统计，脑出血早期病死率达到49.4%，仅半数患者预后良好[2]。脑出血后血红蛋白破入脑内引起继发性血脑屏障破坏、局灶性水肿、神经元及神经胶质细胞凋亡等是导致神经功能损伤的重要原因[3-4]。血红素氧化酶1(Heme oxygenase 1,HO-1)是人体内血红蛋白分解产物-血红素分解的限速酶，在脑出血后迅速被激活，减轻血肿周围炎症反应[5-6]。CD36为B类清道夫受体(Class B scavenger receptor，SR)家族的一员，介导包括红细胞在内的凋亡及受损细胞的吞噬及清除，促进血肿吸收，成为脑出血治疗最新靶点之一[7-8]。

课题组前期证实[9-11]，针刺改善急性脑出血大鼠的神经功能缺损症状，减轻急性期脑组织病理损伤和超微结构损害，但未从促进血肿吸收角度探讨其相关机制。本实验采用自体血注入大鼠脑内，建立脑出血模型，针刺“百会”透“曲鬓”穴干预，观察脑出血大鼠的血肿吸收情况及针刺对CD36、HO-1表达的影响，从血肿吸收角度探讨针刺治疗脑出血的相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康SPF级雄性Wistar大鼠，8周龄，体质量(300±20)g[吉林大学白求恩医学院动物实验中心提供 ，动物许可证号SCXK(吉)2013-0004]。动物饲养于人工控制条件下，大鼠同室、分笼饲养。在温度(22±3)℃、相对湿度 (60±5)%和12/12明暗变化条件下饲养。实验遵循科技部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》相关规定。

1.2 主要试剂及仪器

CD36多克隆抗体(WL02390,万类生物科技有限公司，中国)；HO-1多克隆抗体(WL02400,万类生物科技有限公司，中国)；内参抗体 β-actin (WL01845,万类生物科技有限公司，中国)；立体定位仪(ST-5ND-C，中国成都仪器厂)；电泳仪(DYY-7C，北京六一生物科技有限公司)；双垂直蛋白电泳仪(DYCZ-24DN，北京六一生物科技有限公司)。

1.3 造模方法

参照相关文献[12]制作实验性脑出血大鼠模型。1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，俯卧位固定于立体定位仪上，备皮、消毒、切口，剥离骨膜，暴露前囟及冠状缝，取前囟点(Bregma点)右旁开3.5 mm、后0.2 mm定点，用牙科钻钻直径为1.0 mm的圆孔，深达硬脑膜表面。用微量注射器取尾静脉血50 μL，固定于立体定位仪上，沿钻孔进针约6 mm，以20 μL/min速度将未肝素化的血液50 μL推进尾壳核，留针约5 min，缓慢出针。假手术组接受类似模型组的各项手术操作，但不进行注血。术后采用Berderson评分法[13]评估清醒大鼠神经功能缺损，1～3分的大鼠纳入实验。

1.4 分组及干预方法

采用随机数字表法将108只大鼠分为假手术组、模型组和针刺组，每组36只。每组再按1、3、7 d时间点再分为3个亚组(n=12)。假手术组接受类似模型组的各项手术操作，但不进行注血制作。模型组仅接受脑出血模型制作，不进行任何干预。针刺组：制作脑出血模型,造模后12 h开始治疗,参照《实验针灸学》[14]选取大鼠“百会”穴、患侧“曲鬓”穴，采取“百会”穴透刺“曲鬓”穴，0.30 mm×25 mm毫针针刺，进针20 mm，留针30 min，1次/d。

1.5 指标及检测方法

1.5.1 神经行为学评分 各组大鼠在相应时间点(术后1 d、3 d、7 d)采用改良的神经功能缺损评分(modified Neurological Severity Scores,mNSS)对大鼠的运动、感觉及反射功能进行评估[15-16]。

1.5.2 脑血肿体积 各组大鼠在相应时间点(术后1 d、3 d、7 d)，麻醉后开颅取脑固定，测出血肿最大层面最长的互为垂直的横径与纵径，HE 染色。根据多田公式算出相应的血肿体积，血肿体积=π/6×血肿最大层面最长横径(mm)×纵径(mm)×血肿层数×层厚(mm)。

1.5.3 脑水肿含量 用吸水纸吸干脑组织表面水分，迅速放入事先称重(A)的带盖的小玻璃瓶中，立即称重(B)，B-A即得湿重；烘干24 h，取出待测脑组织恢复到室温，再加盖称重(C)，C-A即得干重，反复称量至恒重[17]。称重用电子天平，精确度为0.1 mg。公式：(湿重-干重)/湿重×100%，即(B-C)/(B-A)×100%。

1.5.4 Western blot检测血肿周围脑组织HO-1、CD36表达 将脑组织匀浆离心后取上清液，采用BCA(Bicinchoninic acid)法测定蛋白量。取30 μL处理后的蛋白样品，采用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PACE)转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，以标准蛋白Maker为参照，5%脱脂奶粉封闭，相应条带分别加入HO-1(1∶500)、CD36(1∶500)，4 ℃孵育过夜。显色完成后，将硝酸纤维素膜移至蒸馏水中终止显色。用滤纸将膜吸干，避光放置20 min后，将膜置于扫描仪中扫描，用凝胶图象处理系统(Gel-Pro-Analyzer软件)分析目标条带的光密度值。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠mNSS评分比较

假手术组术后无明显神经功能缺损表现。模型组大鼠术后1 d已表现出神经功能缺损症状，3 d神经缺损症状最重；与模型组比较，针刺组各时间大鼠神经功能评分明显降低(P<0.01)。见表1。

表1 各组大鼠mNSS评分比较

2.2 各组大鼠脑血肿体积比较

假手术组大鼠脑组织无血肿，模型组可见明显血肿，术后3 d血肿体积最大。与模型组比较，针刺组术后3 d血肿体积明显降低(P<0.01)；术后7 d大鼠血肿体积降低(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠脑血肿体积比较

2.3 各组大鼠脑水肿含量比较

假手术组各时间点脑水含量差异无统计学意义。模型组大鼠各时间点脑水肿含量较假手术组明显增多(P<0.01)；针刺组大鼠各时间点脑水含量较模型组明显降低(P<0.01)。见表3。

表3 各组大鼠脑水肿含量比较

2.4 各组大鼠血肿周围脑组织HO-1、CD36蛋白表达

假手术组可见HO-1弱阳性表达。模型组HO-1蛋白表达增高，术后3 d相对表达最多。与模型组相比，各时间点(1 d、3 d和7 d)针刺组HO-1蛋白表达明显升高(P<0.01)。见表4、图1。

图1 各组大鼠脑组织HO-1蛋白表达

表4 各组大鼠脑组织HO-1 Western blot结果

假手术组可见CD36弱阳性表达。模型组CD36蛋白表达增高，与假手术组比较差异有统计学意义(P<0.01)；针刺组大鼠各时间点CD36表达较模型组显著增加，差异有统计学意义(P<0.01)。见表5、图2。

图2 各组大鼠脑组织CD36蛋白表达

表5 各组大鼠脑组织CD36 Western blot结果

3 讨论

脑出血是一种严重的卒中类型，占所有卒中的10%～15%[18]，死亡率可高达50%[19]。脑出血后在发病后几个小时内即可出现由颅内脑实质血肿造成脑组织机械损伤，其损伤程度与出血量及血肿体积相关[20]。因此，如何有效地清除脑血肿，减轻血肿对脑组织的压迫是脑出血研究的关键问题。脑出血后的脑损伤涉及的脑水肿、炎症反应及血肿清除中均发现HO-1参与其中[21]。CD36作为清道夫受体的一员，已明确参与脑出血血肿清除过程[22-24]。因此本实验采用头针干预脑出血大鼠，研究其对脑出血大鼠HO-1及CD36的作用。

针灸治疗脑出血在临床中已应用几十年，疗效肯定，具有良好的安全性[25-27]。百会穴，位居巅顶，位属于督脉，百会穴为各经脉气会集之处，通达阴阳脉络，可升可降。曲鬓穴，归足少阳胆经，为足太阳、少阳之会，使气血调和、经络畅通，从而起到疗瘫起废的作用。督脉百会穴与颞部胆经曲鬓穴之间的连线又称为顶颞后斜线，一穴区横跨顶、额、颞3区，此线斜穿3条经脉：督脉、足太阳膀胱经及足少阳胆经，其经络调节可纵贯全身。

脑出血后脑组织发生继发性损伤如血红蛋白毒性作用、凝血酶释放、局部脑组织血流量减少和炎性反应等可加重脑出血后神经功能缺损[28-30]。HO-1见于神经元细胞、神经胶质细胞和小胶质细胞等，小胶质细胞HO-1对于减轻神经元细胞死亡和认知功能障碍以及促进红细胞吞噬起重要作用[31-32]。脑出血后HO-1大量表达，随出血时间变化逐渐增高，通过代谢血红蛋白而减轻氧化应激和炎症反应，与炎症反应呈负相关性[33-35]。Wang等[36]发现脑出血后早期(1～7 d)HO-1表达的增加起到了保护作用，而后期(7 d后)HO-1过度表达可加重神经功能损伤。Fan等[37]发现HO-1抑制炎症反应和神经元细胞凋亡而发挥脑保护作用。

近年来，CD36在脑出血的病理过程中发挥的作用引起研究者们的关注[38]。敲除CD36的小鼠脑出血后血肿吸收速度明显减慢，神经功能缺损加重，脑含水量亦增多，多种炎症因子分泌增多，强调CD36参与了血肿吸收，并与神经功能的预后相关[39]。许多学者证实上调血肿周围小胶质细胞 CD36的表达，促进M2表型极化，促进血肿吸收，发挥脑保护作用，成为脑出血治疗的新靶点[22-24]。

本实验选用mNSS评分法对脑出血后大鼠神经功能进行评估，mNSS评分法从运动、感觉和反射等方面对大鼠的神经功能全面评估，实验中观察到模型组大鼠出现不同程度神经功能缺损症状，尤其在运动和感觉实验中表现更为明显，在术后第1天时模型组大鼠神经评分最高，至术后7 d大鼠神经功能缺损症状逐渐减轻。针刺组神经功能评分与模型组相比明显降低，说明针刺能够有效降低脑出血大鼠神经功能评分，改善神经功能缺损症状。脑血肿体积及脑水含量结果显示，相比模型组，针刺组血肿体体积明显减小，脑水含量显著降低，提示针刺能够减小脑出血大鼠血肿体积，减轻局部水肿程度，减轻血肿对周围组织的压迫。Western-blot结果可见模型组HO-1、CD36蛋白表达增高，而针刺组HO-1、CD36蛋白表达较模型组升高，说明针刺可以促进血肿周围脑组织HO-1、CD36蛋白表达，发挥神经保护作用。

综上，本研究结果表明针刺“百会”透“曲鬓”穴可能通过促进脑出血大鼠血肿周围脑组织HO-1、CD36蛋白的表达，减小血肿体积，降低脑水含量，减轻血肿压迫，降低神经功能评分，进而改善神经功能缺损表现。