普罗布考通过p38MAPK途径对房颤动物模型心房肌细胞凋亡的影响

杨菲，张敏，刘蓉

研究显示炎症反应、蛋白质的浸润与心房颤动（房颤，AF）有关，炎症涉及与房颤相关的各种病理过程（包括氧化应激、纤维化和血栓形成）。最新研究显示心房肌细胞的凋亡是引起房颤进展的重要机制[1]。普罗布考是治疗高胆固醇血症的药物，同时可抑制炎性反应。临床研究发现对冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）患者使用普罗布考可预防心律失常的发生[2]，普罗布考是否可用于治疗AF尚不清楚。p38MAPK通路是调节细胞炎症、增殖和凋亡的关键通路，研究显示p38MAPK通路的激活会引起快速心房起搏和心脏的重构[3]。本文分析普罗布考通过p38MAPK途径对房颤动物模型心房肌细胞凋亡的影响及作用机理。

1 主要材料与方法

1.1 实验材料SD大鼠（SPF级，雄性，220～250 g，上海斯莱克实验动物中心，中国）。氯化钙和乙酰胆碱（Sigma公司，美国）。RM6240B/C小动物心电图（RM6240B/C，鼠行生物科技，中国）。TUNEL和ELISA试剂盒（碧云天公司，中国）。组织匀浆机（Thermo Fisher Scientific公司，美国）。RIPA裂解缓冲液（中国，北京，Beyotime）。BCA试剂盒（武汉博斯特生物技术有限公司，中国）。抗体购自美国Abcam公司。PVDF膜（Bio-Rad公司，美国）。显微镜（Olympus公司，日本）。

1.2 分组与建模36只大鼠随机分为三组（每组各12只）：Sham组、AF组和AF+普罗布考组。AF组和AF+普罗布考组大鼠按参考文献[4]建立AF模型，先配置AF诱导液（包括10 g/L的氯化钙和33.66 mg/L的乙酰胆碱）。通过腹腔注射AF诱导液，剂量为0.1 ml/100 g，1/d，连续7 d。心电图检测建模情况（f波P波消失未出现AF）。AF+普罗布考组大鼠使用普罗布考灌胃，剂量50 mg/kg，2/d，连续7 d。

1.3 观察指标及方法

1.3.1 心肌电生理水平大鼠处死后取出心脏，将心脏组织放置在Langendorff中静置至自主节律稳定，将氯化银电极放在左心房检测有效不应期（ERP）和90%动作电位时程（APD90），ERP/APD90减小与AF有关。

1.3.2 TUNEL染色检测心肌细胞凋亡将心肌组织用4%的甲醛固定并用梯度醇脱水，包埋于石蜡中，制成厚度5 μm的玻片标本，常规脱蜡、抗原修复处理，并用密封液封闭。将切片在37℃的蛋白酶K溶液（PH=7.5～8）中孵育并修复15 min，加入50 μl的TUNEL反应溶液，37℃孵育1 h，使用PBST洗涤切片。加入100 μl的二氨基联苯胺在37℃下孵育30 min后用PBST洗涤，在显微镜下观察样品。随机选择每个组织的四个视野进行计算并收集平均值。凋亡指数=凋亡核数/（凋亡核数+正常细胞核数）×100%。

1.3.3 ELISA检测炎性因子采集大鼠心脏中血液样本，2000 rpm离心20 min后采上层血清，加入抗体和显色剂，通过酶标仪检测450 nm处的吸光度，根据标准曲线计算白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）浓度。

1.3.4 Western blot检测p38MAPK通路将心肌组织裂解并提取总蛋白，通过BCA法计算浓度，将40 μg的总蛋白用10%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳（90 V，90 min）分离。在100 mV的恒定电压下将分离的蛋白转移到PVDF膜上。将5%牛血清白蛋白加入到PVDF膜中，室温下孵育1 h。将1:500稀释的anti-MKK6、anti-p38MAPK添加到PVDF膜中，4℃孵育过夜。洗涤后在室温下添加二抗孵育1 h，加入ECL试剂盒显影，GAPDH作为内参，用Image J软件分析目标条带的灰度值。

1.4 统计学处理使用SPSS 19.0软件进行分析，数据以平均值±标准偏差（SD）表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 普罗布考对AF大鼠模型心房肌电生理水平的影响AF组的ERP/APD90水平（0.39±0.05）显著低于Sham组（0.69±0.06），P＜0.05，AF+普罗布考组的ERP/APD90水平显著高于AF组（P＜0.05），表1。

表1 各组大鼠ERP/APD90水平比较

2.2 普罗布考对AF大鼠模型心房肌凋亡的影响AF组的凋亡指数（23.42±3.65 %）显著高于Sham组（3.54±0.78%），P＜0.05，AF+普罗布考组的凋亡指数（9.42±1.26%）显著低于AF组（P＜0.05），图1。

图1 TUNEL染色检测普罗布考对AF大鼠模型心房肌凋亡的影响

2.3 普罗布考对AF大鼠模型炎性反应的影响AF组的IL-6（13.75±2.89 pg/ml）和TNF-α（10.95±1.78 pg/ml）水平显著高于Sham组（P＜0.05），AF+普罗布考组的IL-6（9.03±2.54 pg/ml）和TNF-α（7.21±2.93 pg/ml）水平显著低于AF组（P＜0.05），表2。

表2 各组血清IL-6和TNF-α水平比较

2.4 普罗布考对AF大鼠模型p39MAPK通路的影响AF组心房肌细胞中MKK6和p38MAPK蛋白水平显著高于Sham组（P＜0.05），AF+普罗布考组的心房肌细胞中MKK6和p38MAPK蛋白水平显著低于AF组（P＜0.05），图2。

图2 Western blot检测普罗布考对AF大鼠模型心房肌细胞中p39MAPK通路的影响

3 讨论

房颤在人群中患病率为1%，80岁以上患者的患病率＞8%[5]。研究发现炎性反应是AF的发生和进展的重要机制之一，炎性反应不仅改变心房电生理和结构，导致房颤的易感性增加，还会调节钙稳态和钙相关的连接蛋白，或诱导心肌细胞凋亡及纤维化。这些因素均会促进心房结构重塑，进而影响心功能。

心肌细胞的凋亡与房颤有关，研究显示miR-122的上调可通过诱导心肌细胞凋亡参与房颤的发展[6]。普罗布考是一种双酚化合物，具有降血脂、抗炎和抗氧化特性。本研究结果显示对房颤大鼠使用普罗布考灌胃可明显调节ERP/APD90水平，改善心肌细胞电生理；此外，TUNEL染色结果显示普罗布考可显著抑制AF大鼠心房肌细胞的凋亡。研究显示房颤组的炎症和内质网应激会直接导心房细胞凋亡并引起心房纤颤[7]，且在房颤中抑制心房肌细胞的凋亡是治疗房颤，保护心功能的重要途径[8]。提示普罗布考可通过抑制AF大鼠模型心房肌细胞凋亡改善心肌电生理，从而缓解房颤。

心肌梗死后p38MAPK通路的激活会通过促进IL-6和TNF-α的表达引起房颤[9]。此外，激活的p38MAPK通路也是诱导心肌细胞凋亡的重要机制[10]。本研究结果显示AF组的IL-6、TNF-α、MKK6和p38MAPK水平显著高于Sham组，AF+普罗布考组的的IL-6、TNF-α、MKK6和p38MAPK水平显著低于AF组。叶海波等[11]研究发现普罗布考可通过抑制p38MAPK抑制海马神经元凋亡。普罗布考也可通过抑制MAPK信号传导缓解低密度脂蛋白诱导的人肾近端肾小管上皮细胞的凋亡[12]，提示普罗布考通过抑制p38MAPK通路抑制炎性反应，减少AF大鼠模型的心房肌细胞的凋亡。

综上所述，普罗布考通过抑制p38MAPK通路减少AF大鼠模型的心房肌细胞的凋亡，从而调节心肌电生理水平，提示普罗布考对于治疗房颤具有积极的作用，但关于普罗布考调控p38MAPK通路的机制值得进一步研究。