自噬和PI3K/PKB通路在七氟烷麻醉结肠癌手术患者神经认知紊乱中的作用研究

孙帅，吴晓顺

（郑州人民医院，河南 郑州 450003）

结肠癌在老年患者中发病率较高，目前主要通过手术进行治疗。为了减轻手术过程中患者的痛苦，患者一般都需要使用麻醉剂，但全身麻醉后会导致患者的认知能力下降，并引起免疫功能障碍和其他不良反应，进而降低患者的生活质量并影响其预后。目前，七氟烷在临床常用于麻醉。小鼠体内和体外研究已显示，七氟烷对细胞凋亡、内质网应激、突触形成障碍、线粒体功能障碍和神经炎症影响，这些作用可能会对老鼠出现认知障碍并产生影响［1］。然而七氟醚对神经认知损害的潜在机制仍然大部分未知。

磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（PKB）信号通路在生理条件下对细胞生长、增殖和存活起着至关重要的作用，有文献显示，PI3K/PKB信号通路与神经保护作用密切相关，其能够通过调控PI3K/PKB 信号通路，抑制炎症、细胞凋亡和氧化应激，改善神经发生和认知能力［2］。自噬是一种分解代谢过程，其中错误折叠或聚集的蛋白质、脂质和细胞器被吞噬在双膜囊泡中，以平衡其在细胞中的合成。处在压力下，细胞死亡具有立即/坏死细胞死亡和延迟/凋亡细胞死亡两种潜在途径。近年来已有证据表明，自噬的上调可以预防神经退行性变［3］。而且已有动物实验证明，自噬可以在七氟醚暴露下降解错误折叠的蛋白质并改善凋亡，改善神经退行性衰老大鼠的认知障碍［4］。多种分子和信号通路在调节细胞自噬中起着至关重要的作用，例如自噬相关基因家族和PI3K/PKB 信号通路。

已有研究表明，七氟烷对术后认知功能的保护具有积极作用［5］，但是关于七氟烷是否通过PI3K-Akt 通路和自噬影响结肠癌手术患者认知功能的研究较少。本研究重点探讨七氟烷麻醉结肠癌手术患者自噬和PI3K/PKB 通路的变化及其与患者认知功能的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016 年1 月至2019 年1 月在郑州人民医院接受腹腔镜下结肠癌根治术治疗的100 例老年结肠癌患者作为研究对象，并随机分为SEV 组（麻醉通过七氟醚）和ISO 组（麻醉通过异氟烷），每组50 例。ISO 组男性31 例，女性19 例；年龄65～79 岁，平均（70.48±6.28）岁；TNM 分期：Ⅰ期21 例，Ⅱ期29 例；合并疾病类型：高血压15 例；糖尿病16 例；高血脂18 例；吸烟史31例；饮酒史35 例。SEV 组男性31 例，女性19例；年 龄65～79 岁，平 均（70.48±6.28）岁。TNM 分期：Ⅰ期24 例，Ⅱ期26 例；合并疾病类型：高血压17 例，糖尿病14 例，高血脂19 例，吸烟史33 例，饮酒史32 例。纳入标准：①符合《中国结直肠癌诊疗规范》中结肠癌诊断标准；②早期单发病灶；③符合美国麻醉医师协会分级Ⅰ～Ⅱ级；④自愿签署知情同意书。排除标准：①接受过化疗或免疫治疗；②合并内分泌疾病或免疫性疾病；③合并其他恶性肿瘤或精神性疾病或语言交流障碍。本研究通过医院伦理委员会批准。

1.2 方法

手术前半小时，所有患者肌肉注射阿托品0.3 mg。监测血液动力学指标，包括心率、收缩期血压、舒张压和脉搏氧饱和度。若发现任何异常，立即终止麻醉。静脉注射咪达唑仑（0.05 mg/kg）、维库溴铵（0.1 mg/kg）、丙泊酚（1.0 mg/kg）和瑞芬太尼（2 μg/kg）进行麻醉诱导，在此期间密切观察对患者的麻醉效果。此外，患者通过气管插管进行机械通气，并设定相关参数：在正常情况下，呼吸频率设为12 次/min，机械通气潮气量约为8 mL/kg，呼气二氧化碳分压为35～40 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），吸气/呼气比约为0.5。SEV组使用七氟醚维持麻醉，ISO 组使用异氟烷维持麻醉。设定最低肺泡浓度，手术结束后终止麻醉。

1.2.1 样本采集 收集患者手术前、手术后1 d 血液4 mL，抗凝处理后，其中2 mL 以3 000 r/min 离心8 min，取上清液，剩余血液采用RIPA 裂解液提取蛋白。

1.2.2 Western blotting 法检测LC3Ⅰ和LC3Ⅱ表达水平 血液标本经RIPA 裂解缓冲液冰上处理15 min。以12 000 g 离心10 min 后收集上清液，并通过BCA 试剂盒测定蛋白质浓度。蛋白质样品经过13.5% 的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转移到硝酸纤维素膜上。用5%脱脂奶封闭2 h 后，将膜与LC3Ⅰ和LC3Ⅱ的一抗在4°C 下孵育过夜。将膜用带有Tween 20 的Tris 缓冲盐水洗涤，并在室温下与辣根过氧化物酶结合的二抗孵育2 h。使用ECL Plus 蛋白质印迹检测系统（美国Perkin Elmer 公司）对条带进行可视化，并在C-DiGit 印迹扫描仪上显影膜。使用Image Studio 1.1 版本软件进行量化。

1.3 观察指标

①比较两组手术前、手术后1 d 的血清PI3K和PKB 表达水平；②比较两组简易智力状态检查（MMSE）量表评分：MMSE 评分用于评估患者的认知能力。术后MMSE 评分比术前MMSE 评分降低2 分或更多，被认为是认知功能障碍。③比较两组不良反应数量：认知功能障碍、低血压和心动过缓。低血压标准为收缩压<90 mmHg。窦性心室心动过缓标准是心率<每分钟55 次。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 24.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（）表示，比较用t检验；计数资料以率（%）表示，比较用χ2检验，相关性分析用Pearson 相关分析，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组术前和术后1 d 血清PI3K 和PKB 表达水平比较

两组术后1 d 血清PI3K 和PKB 表达水平较术前增加，差异有统计学意义（P<0.05）。SEV 组术后1 d 血清PI3K 和PKB 表达水平较ISO 组降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1 两组术前和术后1 d 血清PI3K 和PKB 表达水平比较（n=50,,pg/L）

表1 两组术前和术后1 d 血清PI3K 和PKB 表达水平比较（n=50,,pg/L）

2.2 两组术前和术后1 d 血液LC3 Ⅰ和LC3 Ⅱ表达水平比较

两组术后1 d 血液LC3 Ⅱ表达水平较术前降低，差异有统计学意义（P<0.05）。SEV 组术后1 d血液LC3 Ⅱ表达水平较ISO 组增加，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1 和表2。

图1 两组LC3 Ⅰ和LC3 Ⅱ表达水平

表2 两组术前和术后1 d 血液LC3Ⅰ和LC3Ⅱ表达水平比较（n=50,）

表2 两组术前和术后1 d 血液LC3Ⅰ和LC3Ⅱ表达水平比较（n=50,）

2.3 两组术前和术后1 d 的MMSE 评分比较

两组术后1 d 的MMSE 评分较术前降低，差异有统计学意义（P<0.05）。SEV 组术后1 d 的MMSE 评分较ISO 组增加，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

表3 两组术前和术后1 d 的MMSE 评分比较（n=50,,分）

表3 两组术前和术后1 d 的MMSE 评分比较（n=50,,分）

2.4 两组术后不良反应率比较

SEV 组术后1 d 发生认知功能障碍发生率低于ISO 组，差异有统计学意义（P<0.05）。两组术后低血压、心动过缓发生率比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表4。

表4 两组术后不良反应发生情况 ［n=50,n(%)］

2.5 MMSE 评分与PI3K 和PKB 表达水平及与LC3 Ⅰ和LC3 Ⅱ水平的相关性分析

经Pearson 相关性分析，结果显示MMSE 评分与PI3K 和PKB 表达水平呈负相关关系（r=-0.412和-0.398，均P<0.001），而与LC3Ⅰ和LC3Ⅱ水平呈正相关关系（r=0.452 和0.427，均P<0.001）。

3 讨论

老年患者手术后常发生认知障碍，术后认知障碍的机制相对复杂，其涉及麻醉刺激、手术创伤和其他因素。一旦发生认知障碍，患者会出现记忆力减退和言语障碍等症状，并导致患者住院时间延长，严重影响患者的预后。七氟醚吸入麻醉是手术麻醉的重要方法，具有独特的镇静和镇痛作用，且不会引起呼吸抑制，对术后具有稳定的血液动力学和神经保护作用，并能够促进神经功能的恢复。已有研究显示，PI3K/PKB 信号通路和自噬在麻醉药物所导致的神经元损伤中起着重要作用［6-7］。

PI3K/PKB 信号通路不仅在细胞增殖和凋亡中起着关键作用，而且在调节人体的炎症反应中也起着重要作用。有研究显示，抑制PI3K/PKB/GSK-3β信号通路的激活可以有效改善神经性疼痛大鼠的病情和认知障碍［8］，而七氟烷可以改善大鼠反复受到麻醉刺激引起的神经认知损害［9］。本研究结果显示，两组术前PI3K 和PKB 水平比较无差异，两组术后1 d 血清PI3K 和PKB 水平较术前增加。SEV 组术后1 d 血清PI3K 和PKB 水平低于ISO组，比较有差异，提示七氟烷可有效降低患者血清中PI3K 和PKB 水平，七氟烷参与了PI3K/PKB通路在患者中的作用。有研究表明，七氟烷后处理可以通过PI3K/PKB/eNOS 和PI3K/PKB/GSK-3β通路对新生大鼠的缺氧、缺血性脑损伤产生神经保护作用［10］。

自噬是细胞中功能障碍的细胞器或聚集蛋白更新的降解途径，作为对细胞凋亡的防御反应，自噬被激活以维持细胞稳态并通过阻断细胞凋亡途径促进细胞存活。近年来已有证据表明，自噬的上调可以预防神经退行性变。因此，自噬的调节可能是某些神经退行性疾病（如阿尔茨海默病、亨廷顿病和帕金森病）的一种新的治疗策略［11］。已有研究显示，暴露在七氟烷下的老年大鼠在麻醉诱导的应激可能会改变海马水平和认知功能［12］。本研究中，两组术前LC3Ⅰ和LC3Ⅱ水平比较无差异；两组术后1 d 的LC3Ⅰ和LC3Ⅱ水平低于手术前，且SEV 组术后1 d 的LC3Ⅰ和LC3Ⅱ水平高于ISO 组，比较有差异，提示七氟烷可有效增加患者LC3Ⅰ和LC3Ⅱ水平。PI3K/PKB 通路与细胞生长、分化和存活有关，PI3K/PKB 通路激活原则上将损伤神经元并抑制自噬；与此相反，自噬的诱导（mTOR 的抑制）可能会由于持续自噬去除损伤的神经细胞。本研究中，SEV 组术后1 d 血清PI3K和PKB 水平低于ISO 组，LC3Ⅰ和LC3Ⅱ水平明显高于对照组，说明七氟烷可能通过抑制PI3K/PKB通路，促进神经细胞自噬，改善神经功能。

本研究结果还显示，SEV 组认知功能障碍数量明显低于ISO 组，而ISO 组MMSE 评分显著低于SEV 组，表明七氟烷在提高MMSE 评分、减少认知功能障碍和减少术后不良反应有积极作用。相关分析结果表明，MMSE 评分与PI3K 和PKB 的表达水平呈负相关关系，而LC3Ⅰ和LC3Ⅱ水平呈正相关关系，说明七氟烷可以降低血清PI3K 和PKB，上调LC3Ⅰ和LC3Ⅱ水平，从而改善MMSE评分。

综上所述，七氟烷可以通过PI3K/PKB 信号通路调节神经细胞自噬，改善结肠癌手术患者术后的认知功能，其可以为临床应用提供参考。