应用实时荧光PCR方法鉴别风干牛肉中的成分

庞 婕，胥小荣，孔庆岩，王艳英，赵 冉，牛春玲

（1.承德市食品药品检验检测中心，河北承德 067000；2.天津壹鸣环境科技股份有限公司，天津 300000）

我国经济的迅速发展和人们物质消费水平的不断提高促进了休闲食品的发展，既美味又方便携带的风干牛肉逐渐受到众多年轻人的喜爱。但肉干零食的成本高，其中动物产品掺假是一个严重的问题，一些商家为赚取利润，常使用便宜劣质的马肉、猪肉、鸭肉、鸡肉甚至鼠肉来代替高品质牛羊肉，如欧洲出现的马肉和一些以禽肉代替牛羊肉的掺假案例[1-2]。这不仅侵犯了消费者的合法权益，也严重扰乱了市场秩序。实时荧光PCR自建立以来，在食品检验中得到广泛应用，推动了食品就掺假检验的研究发展。采用实时荧光PCR方法检测肉制品中的动物源性成分已经得到了较多的关注和研究[3]。

随着科学技术的飞速发展，肉类掺假检验技术经历了从宏观到微观、从组织形态鉴别到分子水平检测的发展过程[4]。目前，有关肉类掺假鉴别的方法主要有如下几类：基于肉质形态的感官鉴定技术、基于抗原抗体的酶联免疫吸附（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）技术、基于核酸的聚合酶链式反应（Polymerase Chain reaction，PCR）技术、基于蛋白质组学的生物质谱技术等[5]。其中PCR技术适用于多物种鉴定，并且具有高效、灵敏、准确等优点，在传统PCR技术基础上发展起来的实时荧光PCR技术是一种高特异性、高灵敏度的半定量分析方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

40份风干牛肉，来自10家不同的承德本地风干牛肉生产企业；动物组织基因DNA提取试剂盒、马源性成分核算检测试剂盒（PCR荧光探针法）、牛源性成分核算检测试剂盒（PCR荧光探针法）、鸡源性成分核算检测试剂盒（PCR荧光探针法）、鸭源性成分核算检测试剂盒（PCR荧光探针法），均购于广州双螺旋基因技术有限公司。

1.2 仪器与设备

BIO-RAD（CFX96）实 时 荧 光 定 量 PCR仪；Ohaus（FC5714）离心机；雷磁（HY-2）涡旋混匀仪；荣冠（HH）数显恒温水浴锅；SC1100ⅡB2-X生物安全柜（济南鑫贝西生物技术有限公司）。

1.3 实验方法

（1）样品制备。在样品粉碎区进行，采样过程应快速完成，取样应同批多点采取肌肉组织，样品均质后取0.1 g放入研钵中，加入液氮，待样品冷冻完全后快速、用力研磨至粉末状，研磨时应间断加入液氮以防止材料融化。

（2）在样品中加入裂解液（Buffer MTL）和蛋白酶，使其裂解消化，使DNA释放到裂解液中。然后加入Buffer AL和乙醇。转移至DNA吸附柱子中进行过滤。通过离心，使DNA被吸附上柱子的膜上，而蛋白质等杂质则随溶液滤除。加入Buffer GW1洗去柱子中残留的蛋白和其他杂质，加入Buffer GW2洗去柱子中的盐分，最后用低盐缓冲液（Buffer AE）洗脱DNA，洗脱的DNA可直接用于动物源性成分的检测。

（3）添加模板。剪下所需测试数的已含有反应液的PCR管，放置在室温待解冻后，离心30 s后揭开封口膜，向每管反应液中分别加入5 µL模板，顺序为空白、阴性对照、待测样品模板、阳性对照。盖好配套的PCR管盖后，涡旋混匀30 s，离心1 min，立即进行PCR扩增反应。

（4）扩增反应。使用荧光定量PCR仪，荧光基团选择FAM，淬灭基团NONE。

按照下列条件设置扩增反应：37℃，10 min；95 ℃，5 min；95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，40 个循环。

1.4 结果判定

①检测样品Ct≥18.52，曲线为直线或轻微斜线，无“S”型扩增曲线，样品阴性，不含牛源性成分。②检测样品Ct≤18.52，曲线为“S”型扩增曲线，样品阳性，含有牛源性成分。③检测样品18.52＜Ct＜40.0，需进行一次重复实验。

为确保检验结果的准确性，在进行实际样品检测时，设立空白对照、阴性对照和阳性对照实验。实时荧光PCR反应体系，在检验区进行检测，检测结束后，根据扩增曲线Ct值判定结果。

2 结果与分析

分别对40份风干牛肉的DNA进行提取和扩增。主要针对牛肉中的成分进行分析，通过实验显示，目前市场上牛肉产品质量存在一定问题，用其他肉制产品充当牛肉产品的现象存在，牛源性成分、马源性成分、鸭源性成分、鸡源性成分检测结果的实时荧光PCR曲线见图1至图4。

图1 牛源性成分实时荧光PCR曲线

图2 马源性成分实时荧光PCR曲线

图3 鸭源性成分实时荧光PCR曲线

图4 鸡源性成分实时荧光PCR曲线

本次抽取的风干牛肉的检测结果如下：共40份样品，检出牛源性成分20批，总检出率为50%；马源性成分检出13批，检出率为32%；鸭源性成分7批，检出率为18%；鸡源性成分未检出，检出率为0%。

表1 风干牛肉的检测情况

3 结论与讨论

食品安全质量问题关系民生问题，是不容忽视的重要问题，市场监督管理部门严把质量关。检验部门作为技术支撑，提升技术水平，采用快速、高效的检验方法，为监管保驾护航。牛肉制品及其相关产品随着国民经济发展，人们生活水平提高，尤其旅游产业的迅猛发展，已成为餐桌和出行的必备产品。由此可见，对其产品的质量真伪的监督势在必行。

由于PCR技术具有简便易行、灵敏度高等优点，该技术被广泛应用于食品中的定性检测。虽然实时荧光PCR技术应用于肉类掺假鉴别弥补了传统PCR技术的不足，但仍存在一些问题，PCR技术对样本制备要求较高，且易受到DNA降解、复杂基质干扰等因素影响。不过该方法依然为食品检测尤其是掺假检测提供了新思路，可进一步监管肉类掺假问题，维持正常的市场秩序，为市场监管提供了技术保障。