固相萃取-液相色谱质谱联用测定酱油中的Amadori化合物

赵文杰，付蒙蒙，韩爱坤，秦童童

（河南工业大学 化学化工学院，河南郑州 450001）

美拉德反应是热加工食品中氨基酸与还原糖类之间发生的一系列复杂反应，美拉德反应首先经历氨基酸的氨基与糖的羰基发生亲核加成反应生成席夫碱后重排为烯醇式和酮式糖胺结构的Amadori化合物，后经不同途径降解为醛类、吡嗪类等具有特殊香味的挥发性化合物[1-2]。Amadori化合物是美拉德反应初级阶段生成的关键产物，常用作指示食品热加工程度的标志性指标[3]。通过监测食品中Amadori化合物的含量，可以及时地反映食品加工和储藏过程中美拉德反应的程度，从而更好地控制食品的加工和储存条件。然而由于食品中Amadori化合物结构多样且性质接近，因此对复杂美拉德反应体系中Amadori的准确定量分析需要对样品前处理和色谱分离方法深入研究[4]。

Amadori化合物含有糖和氨基酸结构单元，极性较强且带有电荷，这类化合物在反相C18柱上的保留较弱，随着新型液相色谱技术如硼酸亲和色谱、反相离子配对、阳离子交换、亲水相互作用的广泛应用，逐步改善了Amadori化合物的分离问题，然而开发新的色谱分离方法仍是Amadori测定亟待解决的问题[5-10]。亲水相互作用色谱（HILIC）克服了正相色谱和反相色谱在极性化合物分离过程中的不足，能够提供与反相色谱截然不同的分离选择性并与电喷雾离子源质谱具有很好的兼容性，为强极性和离子型化合物的分离分析提供了新的选择[11]，由于Amadori化合物结构带电荷且极性较强，以亲水相互作用色谱对Amadori化合物进行分离具有较强的优势。

食品中的美拉德反应体系组成非常复杂，除了Amadori化合物之外，还含有碳水化合物、羧酸、色素、萜烯类、烷烃、类脂物、无机盐等多种成分，如果不对食品提取液进行特异性净化和富集以消除基质效应，则不能保证测定的灵敏度和准确性。现存Amadori化合物测定的前处理方法仅包括粉碎、萃取、稀释、等步骤，不能有效去除样品中糖、生物碱等干扰性杂质[12-17]。因此，有必要开发针对复杂美拉德反应体系中Amadori化合物分析的样品前处理新材料和新技术，对提取液进行特异性净化和富集以克服样品基质引起的质谱信号衰减现象。

本实验根据Amadori化合物极性较强、同时含有糖单元和氨基酸的结构特点，提出了一种两步固相萃取技术来提取酱油中Amadori化合物，以阳离子交换树脂来富集Amadori和其他碱性化合物，以苯硼酸亲和固相萃取来特异性保留Amadori化合物，采用亲水相互作用色谱-质谱联用技术对Amadori进行分析，建立了一种酱油中9种Amadori化合物测定的新方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

9种Amadori化合物包括1-脱氧-1-L-丙氨酸-D-果糖（Fru-Ala）、1-脱氧-1-L-缬氨酸-D-果糖（Fru-Val）、1-脱氧-1-L-亮氨酸-D-果糖（Fru-Leu）、1-脱氧-1-L-异亮氨酸-D-果糖（Fru-Ile）、 1-脱氧-1-L-脯氨酸-D-果糖（Fru-Pro）、1-脱氧-1-L-苯丙氨酸-D-果糖（Fru-Phe）、1-脱氧-1-L-色氨酸-D-果糖（Fru-Trp）、1-脱氧-1-L-天冬酰胺-D-果糖（Fru-Asn）和1-脱氧-1-L-谷氨酸-D-果糖（Fru-Glu）购自TRC公司（加拿大），流动相甲醇、乙腈购自Sigma-Aldrich公司（美国），Oasis MCX阳离子交换固相萃取小柱（6 mL）购自Waters公司（美国），Bond Elut PBA固相萃取小柱（6mL）购自Agilent公司（美国），其他试剂均为分析纯。液质联用分析使用Agilent 1200高效液相色谱仪串联API5500三重四极杆质谱分析系统（AppliedBiosystems公司）。

1.2 样品提取与净化

以水将1 mL酱油稀释至20 mL，然后以0.1 mol/L盐酸调节pH为4，将此溶液过Oasis MCX固相萃取小柱（100 mg，6 mL）后，将此小柱与Bond Elut PBA固相萃取串联，以3 mL pH为9的氨水溶液洗脱Oasis MCX固相萃取小柱，洗脱液流过Bond Elut PBA小柱。将串联的两个小柱拆开，以3 mL pH为4的甲酸水溶液洗脱Bond Elut PBA（100 mg，6 mL）小柱，将此溶液定容至100 mL后以HPLC-MS/MS来测定Amadori化合物含量。使用标准曲线法对9种Amadori化合物进行定量分析，标准溶液浓度范围为 0.005 ～ 1 μg/mL。

1.3 液质联用分析条件

（1）色谱条件。色谱柱：默克ZIC-HILIC亲水相互作用色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相：5 mmol/L乙酸铵水溶液（A）和乙腈（B），梯度洗脱程序：0～3 min，15%A→15%A；3～5 min，15%A→30%A；5～20 min，30%A → 40%A；20～ 25 min，40%A→ 40%A；25～30 min，40%A → 15%A。流速：600 μL/min，进样量：5 μL。

（2）质谱条件。电喷雾离子源（ESI），多反应监测正离子模式（MRM）；喷雾电压：5 500 V；离子源温度：550 ℃；气帘气：137.90 kPa；雾化气：413.69 kPa，干燥气：517.11 kPa；碰撞气：62.05 kPa。

2 结果与分析

2.1 样品前处理

美拉德反应体系基质非常复杂，样品若含有糖、氨基酸、有机酸、多羟基醇、色素等杂质，用液相色谱串联质谱分析样品时这些物质会与分析目标物竞争产生正离子，造成较强的基质效应，影响电喷雾离子化效率，易导致灵敏度低，降低准确性。对于非极性成分，多采用C18固相萃取小柱来净化，同时采用Dowex离子交换树脂保留氨基化合物去除糖，但是这种方法不能有效去除含氮碱性化合物[12-13,18]。因此本实验根据Amadori化合物极性较强、同时含有糖单元和氨基酸的结构特点，设计了一种两步固相萃取技术来提取Amadori化合物，首先使用强酸性阳离子交换树脂Oasis MCX富集Amadori化合物及其他碱性化合物，同时去除糖类等其他极性酸性物质，氨水洗脱后过苯硼酸亲和色谱固相萃取小柱，利用碱性条件下硼酸与顺式二羟基化合物之间的亲和识别作用实现对Amadori化合物的富集，同时去除其他杂质，然后根据硼酸与糖的反应产物在酸性条件下不稳定的特点，以甲酸溶液洗脱Amadori化合物[19]，从而同时实现对美拉德反应体系中Amadori化合物的提取和净化。

2.2 色谱质谱联用条件优化

Amadori化合物由糖和氨基酸组成，极性较强且带有电荷，目前对其色谱分离研究存在Amadori化合物在反相C18柱上的保留较弱、反相离子对色谱无法与质谱检测器兼容、亮氨酸和异亮氨酸Amadori化合物难以分离等诸多问题。亲水相互作用色谱（HILIC）克服了正相色谱和反相色谱在极性化合物分离过程中的不足，并与电喷雾离子源质谱具有很好的兼容性。本实验使用乙腈和乙酸铵水溶液为流动相，在梯度洗脱模式下成功分离了9种Amadori化合物。在质谱条件优化时，采用正离子模式，以MRM模式分别对9种Amadori化合物标准溶液进行一级质谱扫描，确定各个化合物的准分子离子峰，并分别优化其裂解电压，以其准分子离子为母离子，通过高纯氮气碰撞对产生的碎片离子进行二质谱扫描，同时优化碰撞能量。选择丰度较高的碎片离子为定性和定量特征离子。通过优化，9种Amadori化合物的色谱保留、定性与定量特征离子及优化后的质谱参数见表1。

表1 Amadori化合物的色谱保留和质谱优化参数

2.3 方法评价

2.3.1 基质效应

基质效应的存在会对分离分析方法的准确度及灵敏度产生重大影响。在本实验中，通过对比纯化后样品基质与溶剂标准溶液曲线的斜率，评估了基质效应对检测结果的影响。对比两条标准曲线的斜率，发现二者比值在0.87～1.12的允许范围内，说明本方法不产生干扰试验准确性的基质效应。

2.3.2 方法的线性范围、检出限和定量限

将配好的标准溶液进样分析，得到对应9种Amadori化合物的标准曲线、线性方程、相关系数、线性范围。选用一定浓度的标准溶液，连续进样10次，得到每种Amadori化合物的标准偏差（SD），以3SD作为检出限，10SD作为定量限，结果如表2所示。该方法的线性范围良好，定量限在30 ～ 45 μg/mL。

表2 方法的线性、相关系数和检测限

2.3.3 回收率和重复性

使用市售的酱油样品考察了方法的回收率和重复性，精确量取酱油1 mL并进样分析，平行6次，得到每种Amadori化合物的RSD，结果为3.1%～7.2%。如表3所示，说明方法的精密度良好。对此酱油样品分别加入高低2个浓度水平的标准溶液。将所得样品处理后进样分析，每个进样3次。得到9种Amadori化合物回收率为83.4%～110.2%，RSD为2.4%～7.3%，说明方法回收率良好。

表3 方法的回收率和精密度

3 结论

本实验开发了一种测定酱油中Amadori化合物的样品前处理方法，将酱油样品调成弱酸性后过强酸性阳离子交换树脂，以氨水溶液洗脱，将洗脱液过苯硼酸亲和固相萃取小柱，以甲酸水溶液洗脱Amadori化合物，实现对酱油样品中Amadori化合物的提取和净化。本方法简单、快速、高灵敏、高通量，尤其在去除基质中干扰物方面表现出高选择性，提高了Amadori化合物测定的灵敏度和准确性，有望进一步拓展更多复杂食品体系中Amadori化合物的测定方法。