miR-944过表达对三阴乳腺癌细胞系MDA-MB-231的侵袭迁移和上皮间质转化抑制作用及其机制

朱克鹏，肖勋蓉，罗义，尹均明，弋文，何英，宋远鹏，杜果城

1川北医学院附属南充市中心医院乳腺外科，四川南充637000；

2川北医学院附属南充市中心医院康复科

三阴乳腺癌（TNBC）是乳腺癌常见的亚型，其雌、孕激素受体和人表皮生长因子受体表达均为阴性，占所有乳腺癌的15%～20%，并且具有恶性程度高，易侵袭、转移的特点，预后较差［1］。尽管随着外科手术、放化疗技术的发展，乳腺癌的治疗效果明显提高，但乳腺癌术后复发转移仍是患者死亡的主要原因［2］。相比于非TNBC，TNBC具有更高的复发及转移率［3］。

微小RNA（miRNA）是一类近年发现的具有转录后调节功能的小分子单链RNA，在肿瘤的发生发展中发挥着重要调控作用［4］。miR-944是近期新发现的一个肿瘤相关的miRNA分子，其参与调控多种肿瘤细胞的增殖、凋亡和转移［5-7］。目前miR-944在TNBC中的作用及机制尚不明确。2020年8月—2021年2月，我们观察了miR-944在TNBC细胞系中的表达变化，探讨了其对TNBC细胞侵袭、迁移能力和上皮间质转化（EMT）的影响，并进一步探讨了其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料人TNBC细胞系MDA-MB-231、MDAMB-453、HCC1806及正常乳腺上皮细胞系HBL-100均购自美国ATCC公司，培养于含10%胎牛血清和1%青霉素—链霉素溶液的细胞培养基，置于37℃、95%饱和湿度及5%CO2的恒温环境中培养，细胞融合度达70%时，应用0.25%胰酶消化传代。TRIzol试剂购自北京达科为生物公司；Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒、qRT-PCR试剂盒均购自大连宝生物公司；miR-944模拟物（miR-944 mimics）、阴性对照物（NC-mimics）及引物均购自上海吉玛制药公司；Transwell小室购自美国Corning公司；Mgtrigel基质胶购自美国BD公司；Ecadherin、Vimentin、Fibronectin、GATA6及GAPDH抗体均购自美国CST公司。

1.2 人TNBC细胞系及正常乳腺上皮细胞系HBL-100中miR-944的检测采用qRT-PCR法。应用TRIzol法提取细胞总RNA，按照逆转录试剂盒说明书操作逆转录获得cDNA，逆转录反应条件：16℃、30 min，45℃、30 min，85℃、5 min。取cDNA和PCR引物，按照qRT-PCR试剂盒说明书配制PCR反应体系及反应参数进行扩增反应，PCR反应条件：94℃、15 min，94℃、30 s，60℃、30 s，72℃、30 s，共40个循环。miR-944引物序列：上游：5＇-AAATTATTGTA‑CATCGGATGAG-3＇，下游：5＇-AAATTGTATAAAGA‑GA AATT-3＇；U6引物序列：上游：5＇-CTCGCTTCG‑GCAGCACA-3＇，下游：5＇-AACGCTTCACGAATTTGC‑GT-3＇。以U6作为内参基因，应用2-ΔΔCt法计算miR-944的相对表达量。TNBC细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-453、HCC1806及正常乳腺上皮细胞系HBL-100中miR-944的相对表达量分别为0.23±0.10、0.51±0.11、0.60±0.09、0.96±0.06。与HBL-100细 胞 相 比，TNBC细 胞 系MDA-MB-231、MDA-MB-453、HCC1806中miR-944的相对表达量均降低（P均＜0.05）。选取miR-944相对表达量最低的MDA-MB-231细胞进行后续实验。

1.3 MDA-MB-231细胞分组及miR-944转染方法收集对数生长期的MDA-MB-231细胞接种于6孔板，将细胞分为2组，即阴性对照组（miR-944-NC组）和miR-944过表达组（miR-944-IN组），待细胞融合度达70%时按照Lipofectamine2000说明书操作，将NC-mimics转染至miR-944-NC组细胞，将miR-944 mimics转染至miR-944-IN组细胞，转染后继续置入37℃、95%饱和湿度及5% CO2的恒温环境中培养48 h后进行后续实验。

1.4 MDA-MB-231细胞miR-944的检测采用qRT-PCR法。详细步骤同1.2。

1.5 MDA-MB-231细胞迁移能力检测采用细胞划痕实验。收集各组MDA-MB-231细胞，接种至6孔细胞板，细胞密度2×105个/孔，置入37℃、95%饱和湿度及5% CO2的恒温环境中培养，待细胞铺至90%后，使用100 μL移液枪头垂直细胞板上制造“一”形划痕，PBS冲洗细胞板3次后，继续培养24 h。显微镜下观察“一”形划痕愈合情况，计算划痕愈合率（%）表示细胞迁移能力。

1.6 MDA-MB-231细胞侵袭能力检测采用Tran‑swell侵袭实验。从-20℃冰箱取出Mgtrigel基质胶，对Transwell小室底膜上室面进行均匀预铺。收集各组MDA-MB-231细胞，无血清细胞培养基重悬各组细胞制作细胞悬液，细胞密度1×105/mL。各组取200 μL细胞悬液接种至Transwell小室上室，下室加入600 μL含10%胎牛血清的细胞培养基，置于37℃、95%饱和湿度及5% CO2的恒温环境中培养48 h后取出Transwell小室，拭除小室上室面未穿膜的细胞后，以4%多聚甲醛固定细胞30 min，然后用0.1%结晶紫溶液染色10 min，应用显微镜观察并拍照，随机选择6个不重复的视野计数细胞数目。

1.7 MDA-MB-231细胞中E-cadherin、Vimentin、Fi‑bronectin、GATA6蛋白的检测采用Western blot‑ting法。收集各组MDA-MB-231细胞，应用细胞裂解液裂解，抽取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。按照每泳道30 μg蛋白样品进行上样，经100 g/L的SDS-PAGE电泳分离，电转移至PVDF膜，洗膜后，将膜置于50 g/L的脱脂奶粉封闭液中封闭1 h，洗膜后置入稀释的一抗E-cadherin（稀释度1∶500）、Fibro‑nectin（稀 释 度1∶1 000）、Vimentin（稀 释 度1∶1 000）、GATA6（稀释度1∶1000）和GAPDH（稀释度1∶1 000）溶液中继续室温孵育2 h，次日洗膜后置于稀释的二抗（稀释度1∶2 000）溶液中，室温孵育1 h，加入ECL显影液显影。采用Quality One软件计算各蛋白的相对表达量。

1.8 统计学方法采用SPSS20.0统计软件。计量资料以-x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-944-IN组 和miR-944-NC组miR-944相 对表达量比较miR-944-IN组和miR-944-NC组MDAMB-231细胞中miR-944的相对表达量分别为4.23 ±0.23、1.02±0.03。与miR-944-NC组 相比，miR-944-IN组MDA-MB-231细 胞 中miR-944的相对表达量升高（P＜0.05），提示转染效率较高，过表达miR-944的MDA-MB-231细胞构建成功。

2.2 miR-944-IN组 和miR-944-NC组MDA-MB-231细胞迁移、侵袭能力比较miR-944-NC组和miR-944-IN组MDA-MB-231细胞的划痕愈合率分别为67.1%±5.8%、22.6%±3.2%。与miR-944-NC组相比，miR-944-IN组MDA-MB-231细胞划痕愈合率降低（P＜0.05）。miR-944-IN组和miR-944-NC组穿膜细胞数量分别为（130±21）、（264±34）个。与miR-944-NC组相比，miR-944-IN组穿膜细胞数明显减少（P＜0.05），见图1。

图1 两组侵袭细胞显微镜下表现

2.3 miR-944-IN组和miR-944-NC组细胞中EMT相关标志物E-cadherin、Fibronectin、Vimentin蛋白及GATA6蛋白相对表达量比较与miR-944-NC组相比，miR-944-IN组细胞E-cadherin蛋白相对表达量升高（P＜0.05），Fibronectin、Vimentin蛋白相对表达量降低（P均＜0.05）。与miR-944-NC组相比，miR-944-IN组细胞中GATA6蛋白相对表达量降低（P＜0.05）。两组EMT相关蛋白、GATA6蛋白相对表达量见表1。

表1 两组EMT相关蛋白、GATA6蛋白相对表达量（±s）

表1 两组EMT相关蛋白、GATA6蛋白相对表达量（±s）

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3 讨论

乳腺癌是世界范围内女性最常见的恶性肿瘤。据美国癌症协会报道，乳腺癌占所有新发癌症病例的30%，是女性癌症相关性死亡的主要原因［8］。乳腺癌具有高度的异质性，为了进一步完善临床诊断，根据雌、孕激素受体和人表皮生长因子受体表达的免疫组化特征，又将乳腺癌分为几个分子亚型，包括Luminal A型乳腺癌、Luminal B型乳腺癌、HER-2阳性乳腺癌和TNBC，其中TNBC具有恶性程度高、发病年龄低、易转移、复发率高、预后差的特点，目前仍缺乏有效的治疗手段［9］。因此，开发探索一种新的靶向治疗方法以提高TNBC的临床疗效具有重要意义。

miRNAs是非编码的单链小分子RNA，含有约22个核苷酸，是靶基因的转录后调节因子。研究显示，miRNAs在多种生物过程中发挥重要作用［10］。近年越来越多的证据表明，miRNAs参与了癌症的发生及进展，作为癌基因或抑癌基因发挥重要的调控作用。miRNA在癌症标志物及靶向治疗方面的研究已经成为当前研究的热点问题［11］。miR-944是新发现的肿瘤相关miRNA分子，与肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭有关［12］。研究显示，miR-944能够抑制鼻咽癌［13］、肺腺癌［14］、结直肠癌［15］、胃癌［16］等肿瘤细胞的生长及转移，但在宫颈癌［17-18］、子宫内膜癌［19］、食管鳞癌［20］等肿瘤的研究中却发现，miR-944作为癌基因起着促进肿瘤细胞生长转移的作用，提示miR-944在不同的癌症中具有高度异质性。至今，miR-944对TNBC细胞生长及转移的影响和机制尚不清楚。本研究发现，miR-944在TNBC细胞系中的表达较正常乳腺上皮细胞系明显降低，提示miR-944在TNBC中可能作为抑癌基因发挥作用。本研究通过转染miR-944模拟物使得MDA-MB-231细胞中miR-944过表达，细胞划痕实验和Transwell侵袭实验结果显示，过表达miR-944后的MDA-MB-231细胞迁移和侵袭能力均明显降低，进一步证实miR-944能够抑制TNBC细胞的侵袭和转移。

研究显示EMT是影响癌细胞侵袭迁移的关键性环节，逆转肿瘤细胞EMT是抑制肿瘤侵袭转移的重要策略［21］。本研究证实过表达miR-944的MDAMB-231细胞上皮细胞源性标志物E-cadherin蛋白的相对表达量显著升高，间质细胞源性标志物Fibro‑nectin、Vimentin等蛋白的相对表达量显著降低，提示miR-944对TNBC细胞侵袭迁移能力的影响与其对EMT的调控有关。

GATA6属GATA转录因子家族，具有高度保守的锌指结构，能够识别并结合GATA序列，在组织细胞的生长、发育及分化中均起着重要的作用［22］。目前较多研究发现，GATA6与多种肿瘤的发生发展有关，并且与肿瘤的EMT有关［23-24］。目前研究也已经证实，GATA6在乳腺癌组织和细胞中表达升高，并且促进乳腺癌细胞的生长、转移及EMT［25-26］。研究显示，GATA6作为miR-944的调控靶基因在恶性肿瘤的生长转移及EMT的调控中发挥重要的作用［27-28］。本研究发现，过表达miR-944的MDA-MB-231细胞GATA6蛋白的相对表达量显著降低，提示miR-944对TNBC细胞侵袭迁移及EMT的影响可能与其对GATA6的调控有关。

综上所述，miR-944在TNBC细胞系中相对表达量降低。过表达miR-944能够抑制TNBC细胞的迁移、侵袭及EMT，其机制可能与其对GATA6基因的调控有关，为TNBC的靶向治疗提供了新的研究方向。本研究并没有对miR-944在TNBC组织中表达进行检测，有待进一步检测miR-944在TNBC组织中表达情况，探讨其表达与TNBC患者临床病理特征的关系。