喉癌组织中转录活性因子4和血管内皮生长因子的表达变化及其意义

杨雪，冯志星，彭丽娜，马海滨，单珊，韩海平

邯郸市中心医院耳鼻喉科，河北邯郸056000

喉癌是耳鼻咽喉头颈部常见的恶性肿瘤，具有侵袭性强、早期易转移、易复发等特点，临床预后较差［1］。喉癌早期易发生淋巴结转移且浸润性较强，因此部分患者就诊时已处于中晚期，临床治疗较为困难［2］。杜瑞霞等［3］报道，淋巴管生成增加和淋巴结转移是影响喉癌患者预后的重要因素，研究喉癌淋巴管生成和淋巴结转移机制对于喉癌的诊断及预后判断具有重要意义。转录活性因子4（ATF4）是未折叠蛋白反应通路中的重要调节因子，与应激反应、损伤、细胞增殖等有密切关系［4］。PANG等［5］报道，ATF4是肿瘤细胞重要的应激因子，参与肿瘤生成、发展和转移。血管内皮生长因子（VEGF）是目前已知的能够促进血管内皮和淋巴管内皮生长的因子。邢海霞等［6］报道，VEGF与乳腺癌淋巴道转移有密切关系。但在喉癌淋巴管生成和淋巴结转移中研究报道较少。我们首先观察了喉癌组织中ATF4和VEGF的表达情况，进一步探讨了喉癌组织中ATF4、VEGF表达与患者淋巴管生成、淋巴结转移及预后的关系，以期为喉癌诊治和预后预测提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料2015年6月—2017年12月选择河北省邯郸市中心医院收治的喉癌患者60例，男41例、女19例；年龄39~79（58.17±8.74）岁；分型：声门上型21例、声门下型8例、声门型31例；组织学分化程度：高分化21例、中分化24例、低分化15例。无淋巴结转移39例，有淋巴结转移21例；国际抗癌联盟TNM分期：Ⅰ期8例、Ⅱ期14例、Ⅲ期23例、Ⅳ期15例；有淋巴管浸润20例，无淋巴管浸润40例。纳入标准：均为喉癌初发患者，经病理诊断为喉鳞状细胞癌；均完成3年随访；病例资料完整，患者及家属对研究知情同意；取标本前未进行放、化疗；组织标本含有喉癌组织及距离肿瘤边缘3 cm以上的癌旁组织。排除标准：未完成随访者；合并其他恶性肿瘤者；合并远处转移，预计生存期小于6个月者。所有喉癌患者随访3年，随访截止日期为2020年12月31日。本研究经医院伦理委员会同意（H2014110207）。

1.2 喉癌及癌旁组织中VEGF、ATF4的检测采用免疫组织化学SP法。将喉癌组织及癌旁组织标本经10%中性甲醛溶液固定，脱水、包埋、切片。将切片经二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ脱蜡，各20 min，依次置入100%、95%、90%、85%、80%乙醇溶液中进行水化，各5 min，取切片磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗2次，加入枸橼酸抗原修复液进行高压抗原修复，PBS冲洗3次，取出切片滴加3%过氧化氢，室温下放置10 min，PBS冲洗3次，加入山羊血清工作液封闭15 min，分别加入鼠抗人ATF4、VEGF、D2-40单克隆抗体，4℃下湿盒内过夜，取出后室温下放置30 min，加入生物学二抗反应1 h，PBS冲洗，DAB进行显色，苏木素复染，顺次置于80%、85%、90%、95%、100%梯度乙醇脱水透明，中性树胶封片，显微镜下判定结果。应用说明书中阳性图片作为阳性对照，PBS代替生物学一抗作为阴性对照。

应用半定量积分法对切片赋分［7］：当出现黄色、棕褐色或棕黄色颗粒为表达阳性，在400倍高倍镜下随机观察每个切片5个视野，计算平均值，根据阳性细胞染色程度、阳性细胞所占比例进行赋分：①染色程度积分：无着色、淡黄色、棕黄色、黄褐色分别评分0~3分。②细胞所占比例积分：≤5%、6~25%、26~50%、51~75%、＞75%分别评分0~4分。总分=细胞所占比例积分×染色程度积分，≥4分为阳性，＜4分为阴性。

1.3 微淋巴管密度（LMD）的测算应用D2-40进行免疫组化染色，可见微观、单个内皮细胞或细胞丛被染成黄色、棕黄色或棕褐色的颗粒，凡出现单个孤立的或多个紧密排列的细胞团，与周围肿瘤组织分界清楚可认定为1个微管，在200倍高倍镜下观察3个阳性高密度区，计算微管数平均值作为微淋巴管密度（LMD）［8］。

1.4 统计学方法采用SPSS22.0统计软件。计量数据均通过正态性检验，以±s表示，比较采用校正t检验或成组t检验。计数资料以例数及率表示，比较采用校正χ2检验或χ2检验。相关分析为Spear‑man相关检验。生存等时间队列资料建立Kaplan-Meier乘积限生存曲线模型，生存率比较采用Log Rank检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 喉癌组织及癌旁组织中ATF4、VEGF表达比较ATF4阳性表达位于细胞质；VEGF阳性表达位于细胞质，偶可表达于细胞膜，见图1。喉癌组织中ATF4、VEGF阳性表达率分别为78.33%（47/60）、81.67%（49/60），癌旁组织中分别为11.67%（7/60）、16.67%（10/60），两种组织ATF4、VEGF阳性表达率比较，χ2分别为53.872、50.714，P均＜0.05。

图1 喉癌组织、癌旁组织中ATF4、VEGF表达（×200）

2.2 喉癌组织中ATF4、VEGF阳性表达与患者临床病理特征的关系有淋巴管浸润、有淋巴结转移、TNM分期为Ⅲ+Ⅳ期喉癌患者癌组织中ATF4、VEGF阳性表达率高于无淋巴管浸润、无淋巴结转移、TNM分期为Ⅰ+Ⅱ期者（P均＜0.05），不同年龄、性别、分型、组织分化程度的喉癌组织中ATF4、VEGF阳性表达率比较，P均＞0.05，见表1。

表1 喉癌组织中ATF4、VEGF阳性表达与患者临床病理特征的关系［例］

2.3 喉癌组织中不同ATF4、VEGF表达者LMD比较喉癌组织中ATF4阳性表达者、ATF4阴性表达者LMD分别为（14.26±3.02）、（5.78±1.14）个，两者比较，t=14.303，P=0.000；VEGF阳性表达者及阴性 表 达 者LMD分 别为（18.27±3.25）、（8.12±1.78）个，两者比较，t=15.639，P=0.000。

2.4 喉癌组织中ATF4、VEGF与LMD的相关性赋值ATF4、VEGF的表达阴性=0，阳性=1，而后行Spearman相关分析。结果显示，喉癌组织中ATF4、VEGF表达水平与LMD呈正相关（rs分别为0.632、0.678，P均＜0.01）。

2.5 ATF4、VEGF表达不同的喉癌患者预后比较随访结束时患者死亡19例，存活41例，存活率68.33%。其中ATF4阳性、ATF4阴性患者生存率分别为63.83%（30/47）、84.62%（11/13）；VEGF阳性、VEGF阴性患者生存率分别为63.27%（31/49）、90.91%（10/11）；喉癌组织ATF4阴性、VEGF阴性患者生存率高于ATF4阳性、VEGF阳性患者（Log Rankχ2分别为7.925、8.533，P均＜0.01），见图2、图3。

图2 不同ATF4表达的喉癌患者生存曲线

图3 不同VEGF表达的喉癌患者生存曲线

3 讨论

喉是呼吸道的重要组成部分，是呼吸及发声的重要器官。近年来，喉癌的发病率呈升高趋势，严重影响人们健康。目前临床上对于喉癌主张以手术切除为主的综合治疗，随着手术技术的提高和多种方式联合治疗的不断完善，大部分喉癌患者得以手术治疗，但患者5年生存率并没有显著提升，其中肿瘤浸润和转移是造成患者预后不佳的重要原因［9］。近年来，随着分子生物学研究的不断进展，从分子水平寻找肿瘤诊断和预后判断的靶点成为临床研究的热点问题。通过对喉癌组织中特异性因子表达情况的分析可以有效评价疾病严重程度、预测患者预后。

ATF4是转录活性因子家族的重要成员，也是未折叠蛋白质反应通路中重要的应激反应因子［10］。正常情况下，细胞内蛋白质在内质网内进行加工和折叠，形成结构正常的蛋白质。当在某些致瘤因素下可以导致蛋白质加工障碍，引起蛋白质不能正常折叠，并启动未折叠蛋白质反应，导致蛋白结构异常，细胞增殖和凋亡失衡，进而促进肿瘤的发生［11］。SHARMA等［12-13］报道，在食管癌、肝癌组织中存在ATF4的异常高表达。CHANG等［14］报道，ATF4可以上调细胞程序性死亡配体1等促进肿瘤的浸润和转移。DEY等［15］报道，ATF4可以上调VEGF表达，促进肿瘤新生血管形成和转移。VEGF是促进血管生成和淋巴管生成的重要分子。MA等［16-17］报道，VEGF在乳腺癌、肺癌、胃癌等肿瘤组织中异常高表达。WILKIE等［18］报道，VEGF与肿瘤生长和转移密切相关。本研究结果显示，喉癌组织中存在ATF4、VEGF高表达，说明ATF4、VEGF可能与喉癌的发生、发展有密切关系。本研究中喉癌组织中ATF4阳性表达率与TNM分期、淋巴结转移、淋巴管浸润有关，分析ATF4可能通过上调细胞程序性死亡配体1，抑制细胞凋亡等促进喉癌的发展、淋巴结转移、淋巴管浸润；ATF4也可能通过上调VEGF促进喉癌淋巴结转移、淋巴管浸润，而喉癌组织中VEGF阳性率与TNM分期、淋巴结转移、淋巴管浸润有关，这可能与VEGF促进喉癌新生血管形成、淋巴管生成和淋巴结转移有关［19］。

本研究应用D2-40标记组织中淋巴管内皮细胞，结果显示喉癌组织中ATF4阳性表达者LMD高于ATF4阴性表达者，VEGF阳性者LMD高于VEGF阴性表达者；Spearman相关分析显示，喉癌组织中ATF4、VEGF表达 与LMD呈正相 关，表 明ATF4、VEGF可能促进淋巴管生成和淋巴结转移。笔者分析，当发生喉癌时多种癌基因激活、抑癌基因失活，导致蛋白质折叠障碍，ATF4异常表达，并进一步激活相关通路，促进淋巴管内皮细胞增殖［20］；而VEGF则可以直接促进淋巴管生成和淋巴结转移［21］。此外，本研究中喉癌组织ATF4阴性、VEGF阴性患者生存率显著优于ATF4阳性、VEGF阳性患者，提示喉癌组织中ATF4阳性表达、VEGF阳性表达患者预后不佳。因此，临床上对喉癌组织中ATF4、VEGF表达情况进行检测可能为喉癌患者的预后判断提供帮助。

综上所述，喉癌组织中存在ATF4、VEGF异常高表达，其表达与患者临床分期、淋巴管生成、淋巴结转移及预后有密切关系，提示ATF4、VEGF可能在喉癌辅助诊断和预后预测中具有一定价值，有待进一步探讨。但本研究存在病例数较少的不足，需开展多中心、大样本量的后续研究进一步验证。