miR-214抑制Livin表达对喉鳞状细胞癌细胞增殖和凋亡的影响

罗德艳，冯俊，彭涛，唐一萍，杨久梅

川北医学院第二临床医学院 南充市中心医院耳鼻喉科，四川南充 637000

喉癌是一种发病率较高的头颈部恶性肿瘤，其中绝大多数是喉鳞状细胞癌（LSCC）。随着环境污染的加重及人口老龄化的加剧，LSCC的发病率一直居高不下［1］。LSCC 与遗传、环境、吸烟、饮酒等诸多因素有关，但具体的发病机制尚不明确。尽管近年来LSCC 在诊断和治疗方面取得了一定的进展，但在过去的三十年，LSCC 患者的5年生存率并没有得到明显改善［2］，因此探索新的治疗LSCC 的有效方法意义重大。微小RNA（miRNA）是一类非编码的小分子RNA，在调控细胞发育、分化、增殖和凋亡等过程中发挥重要作用［3］。研究显示，miRNA 可作为癌基因或抑癌基因调控肿瘤的发生发展，这为肿瘤的治疗提供了新的研究方向［4］。基因芯片技术揭示LSCC 组织中存在许多差异表达的miRNA，可能与其发生进展机制有关［5］。miR-214 是近年来发现的与恶性肿瘤有关的miRNA［6］，但至今miR-214 在LSCC 中的作用尚不清楚。2020年9月—2021年2月，本研究观察了miR-214 在LSCC 细胞中的表达情况，并进一步探讨miR-214 表达对LSCC 细胞增殖和凋亡的影响及可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 TRIzol 试剂、LipofectamineTM2000（美国Invitrogen 公司）；蛋白提取试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）；CCK-8 增殖检测试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；Annexin V/FITC细胞凋亡检测试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）；miR-214模拟物（miR-214 mimics）和模拟物阴性对照（miR-NC）、荧光素酶报告基因质粒（上海吉玛制药技术有限公司）；PCR 引物（苏州金唯智生物科技有限公司）；反转录试剂盒、实时荧光定量PCR（RT-qPCR）试剂盒（大连宝生物工程有限公司）；荧光素酶检测试剂盒（美国Promega 公司）；一抗兔抗人Bcl-2、Bax、Livin 和GAPDH 抗体（美国Santa Cruz 公司）；HRP标记的二抗羊抗兔IgG（美国Bioworld）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、转染及分组 人LSCC 细胞FD-LSC-1、TU177及正常永生化表皮细胞Hacat均购自美国ATCC 细胞库，Hep-2由华西医学中心实验室惠赠。 Hep-2、FD-LSC-1、TU177 细胞均培养在含10% 胎牛血清的RPMI1640 培养基中，Hacat 细胞培养在含10% 胎牛血清的DMEM 培养基中。转染操作时，取生长状态良好的对数生长期TU177 细胞接种至6 孔板，细胞分为miR-214 mimics 组和miR-NC组，miR-214 mimics 组每孔加入100 pmol miR-214 mimics 和5 μL 转染试剂，miR-NC 组每孔加入100 pmol miR-NC 和5 μL 转染试剂，按照Lipo⁃fectamineTM2000 试剂说明书操作进行转染，转染后24 h收集细胞进行后续实验。本研究经过我院医学伦理委员会批准。

1.2.2 miR-214 表达检测 采用RT-qPCR 技术。收集Hep-2、FD-LSC-1、TU177、Hacat 细胞以及转染后24 h 的各组TU177 细胞，按照TRIzol 试剂说明书操作提取细胞总RNA，应用反转录试剂盒将提取的总RNA反转录为cDNA。 以cDNA为模板，加入miR-214 及内参U6 引物以及荧光染料，应用RTqPCR 试剂盒配置反应体系进行PCR 反应。PCR 反应条件：94 ℃30 s、94 ℃20 s、60 ℃30 s、72 ℃30 s 40个循环。 miR-214 上游引物序列为5'-TATACAT⁃CAAACAGCAGGCACA-3'，下游引物序列为5'-CATTCGATCTTCTCCACAGTCTC-3'。U6上游引物序列为5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物序列为5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。采用2-∆∆Ct法计算miR-214 相对表达量。

1.2.3 细胞增殖活性检测 采用CCK-8 实验。取转染24 h 后的各组TU177 细胞，按照1×104/孔的细胞密度接种至96 孔板中，继续培养24、48、72 h 后，各孔分别加入10 μL CCK-8 试剂，继续避光培养4 h，酶联免疫检测仪测定各孔450 nm波长处的光密度（OD）值。

1.2.4 细胞克隆形成能力检测 采用平板克隆形成实验。取转染24 h 后的各组TU177 细胞，常规胰酶消化，调整细胞浓度，制备细胞悬液，分别以1 000个/皿的细胞密度接种，常规培养14 d后，4%多聚甲醛固定20 min，染色20 min。应用显微镜下观察细胞克隆形成情况，计数克隆数（超于50个细胞的集落表示为1个克隆）。

1.2.5 细胞凋亡率测算 采用流式细胞术。取转染24 h 后的各组TU177 细胞，加入结合缓冲液重悬调整细胞浓度为1×106/mL，每组取100 μL细胞悬液，加入流式管，按照细胞凋亡检测试剂盒说明书操作先加入Annexin V-FITC 5 μL混匀后，再加入PI 5 μL混匀，避光孵育。1 h内上流式细胞仪进行检测。

1.2.6 细胞中Bcl-2、Bax 和Livin 蛋白检测 采用Western blotting 法。取转染24 h 后的各组TU177 细胞，应用蛋白提取试剂盒提取总蛋白。取30 μg 总蛋白上样，行10% SDS-PAGE 电泳，将蛋白转印到PVDF 膜，5% 脱脂乳4 ℃泡膜4 h，分别加入适当浓度的Bcl-2（稀释度1∶2 000）、Bax（稀释度1∶2 000）、Livin（稀释度1∶1 000）和GAPDH（稀释度1∶2 000）一抗，4 ℃孵育过夜。洗膜后加入HRP 标记的二抗IgG（稀释度1∶5 000），37 ℃孵育2 h 后，ECL 显影液显影，凝胶成像系统采集图像。

1.2.7 miR-214 和Livin 靶向调控关系检测 采用双荧光素酶报告基因实验。收集TU177细胞接种于24 孔板，将细胞分为miR-214 mimics+WT-Livin组、miR-214 mimics+MUT-Livin组、miR-NC+WT-Livin组、miR-NC+MUT-Livin组。将携带野生型和突变型基因靶点Livin 3' UTR的荧光素酶报告基因质粒WT-Livin和MUT-Livin，应用转染试剂LipofectamineTM2000 分别与miR-214 mimics 和miR-NC 共转染至各组TU177细胞，继续培养24 h 后，裂解各组细胞，按照荧光素酶检测试剂盒说明书操作检测细胞的荧光素酶活性。

1.2.8 统计学方法 采用SPSS22. 0 统计软件。符合正态分布的计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析或t检验。P<0. 05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞中miR-214 表达比较 Hep-2、FD-LSC-1、TU177、Hacat 细胞中miR-214 的相对表达量分别为0. 53 ± 0. 09、0. 46 ± 0. 10、0. 19 ± 0. 07、1. 02 ±0. 03，与Hacat细胞相比，Hep-2、FD-LSC-1、TU177细胞中miR-214的相对表达量降低（P均<0. 05），TU177细胞中最低，故选用TU177细胞进行后续实验。

2.2 两组TU177 细胞miR-214 表达比较 miR-214 mimics 组、miR-NC 组miR-214 相对表达量分别为3. 24 ± 0. 26、0. 98 ± 0. 04，与miR-NC 组 相比，miR-214 mimics 组miR-214 相对表达量升高（P<0. 05）。

2.3 两组TU177细胞增殖活性比较 与miR-NC组相比，miR-214 mimics 组24、48、72 h 的OD 值均降低（P均<0. 05），见表1。

表1 两组TU177细胞不同时点OD值比较（± s）

表1 两组TU177细胞不同时点OD值比较（± s）

组别miR-214 mimics组miR-NC组t P OD值24 h 0. 389 ± 0. 080 0. 636 ± 0. 064 4. 176 0. 014 48 h 0. 600 ± 0. 101 1. 089 ± 0. 119 5. 426 0. 006 72 h 1. 078 ± 0. 137 1. 987 ± 0. 202 6. 451 0. 003

2.4 两组TU177 细胞克隆形成情况比较 miR-214 mimics 组、miR-NC 组细胞克隆数分别为（360 ±75）、（890 ± 96）个，与miR-NC组相比，miR-214 mimics组细胞克隆数减少（P<0. 05）。

2.5 两组TU177 细胞凋亡率比较 miR-214 mim⁃ics 组、miR-NC组细胞凋亡率分别为（26. 46 ±5. 73）%、（4. 22 ± 1. 99）%，与miR-NC 组相比，miR-214 mimics组细胞凋亡率升高（P<0. 05）。

2.6 两组TU177 细胞中Bcl-2、Bax 和Livin 蛋白表达比较 与miR-NC 组相比，miR-214 mimics 组细胞中Livin 和Bcl-2 蛋白表达降低（P均<0. 01），Bax 蛋白表达升高（P<0. 01），见表2。

表2 两组TU177细胞中Bcl-2、Bax和Livin蛋白表达比较（± s）

表2 两组TU177细胞中Bcl-2、Bax和Livin蛋白表达比较（± s）

组别miR-214 mimics组miR-NC组t P Bcl-2蛋白0. 21 ± 0. 09 1. 10 ± 0. 11 10. 846<0. 01 Bax蛋白2. 28 ± 0. 19 0. 62 ± 0. 09 13. 676<0. 01 Livin蛋白0. 18 ± 0. 07 0. 98 ± 0. 13 9. 385<0. 01

2.6 各组TU177 细胞相对荧光素酶活性比较 miR-214 mimics+WT-Livin 组、miR-214 mimics+MUT-Livin 组、miR-NC+WT-Livin 组、miR-NC+MUTLivin组细胞相对荧光素酶活性分别为0. 51 ± 0. 10、1. 00 ± 0. 06、1. 03 ± 0. 04、1. 02 ± 0. 06；与miR-NC+WT-Livin 组相比，miR-214 mimics+WT-Livin 组细胞相对荧光素酶活性降低（P<0. 05）；miR-214 mimics+MUT-Livin组与miR-NC+MUT-Livin组细胞相对荧光素酶活性比较差异无统计学意义。

3 讨论

喉癌是呼吸系统第二常见恶性肿瘤，病理类型以LSCC为主。虽然早期LSCC患者的治疗效果尚可，但有60%以上的LSCC患者在明确诊断时已经处于疾病晚期，治疗效果不能令人满意［7］。研究表明，LSCC的恶性进展与一系列基因的改变有关，这些改变的基因可能起着类似癌基因或肿瘤抑制基因的作用。尽管近年来LSCC分子生物学方面有了显著的进步，但其恶性转化和进展过程的基本机制仍然不明确。

众所周知，miRNA 是重要的转录后调节因子，参与了不同细胞中基因表达谱的形成。研究发现，许多miRNA 异常表达在促进或抑制包括喉癌在内的恶性肿瘤的发生、发展中起关键作用［8］。miR-214定位于人类染色体1q24. 3 区DNM3 的14 号内含子上，其基因表达异常已经在许多恶性肿瘤的研究中被报道。LIU 等［9］报道，miR-214 在甲状腺乳头状癌组织和细胞中表达降低，在体外恢复甲状腺乳头状癌细胞miR⁃214 的表达可以显著降低癌细胞的增殖和侵袭能力，促进细胞凋亡。在胃癌［10］、宫颈癌［11］、卵巢癌［12］等研究中也发现miR-214起抑癌基因的作用。但值得注意的是，在乳腺癌［13］、口腔鳞癌［14］、肺癌［15］等恶性肿瘤的研究中却发现癌组织和细胞中miR-214表达升高，起着促进癌细胞增殖、转移和抑制癌细胞凋亡的作用。说明miR-214 在不同的恶性肿瘤中具有很强的异质性，可能通过影响不同的信号通路从而起着不同的作用。目前miR-214在LSCC中的作用机制尚不清楚。本研究发现，miR-214 在LSCC 细胞Hep-2、FD-LSC-1、TU177 中的表达降低，提示其在LSCC 的发生和进展过程可能起着类似抑癌基因的作用。 进一步研究发现，体外上调TU177 细胞中miR-214 的表达后，细胞的增殖活性降低，克隆细胞数减少，凋亡率升高，Bcl-2 表达降低，Bax 表达升高，证实miR-214在LSCC中起着抑癌基因的作用。

研究表明，miRNA 在机体细胞生命活动中的调节作用与其对下游靶基因的调控有关。近期，在肾细胞癌［16］和结肠癌［17］的研究中发现，miR-214能够通过调控Livin 基因参与肿瘤的发生进展。Livin 基因是目前研究较多的凋亡抑制蛋白家族成员，属于内源性抗凋亡因子，其在人体正常的组织中表达较低，但在包括LSCC 在内的众多恶性肿瘤组织细胞中均异常高表达，能够调控NF-κB、MAPKs、JNK等众多信号转导通路，对癌细胞的生长转移及化疗抗药均具有明显的促进作用［18］。既往研究已经证实，抑制LSCC 细胞中Livin 表达，可有效抑制LSCC 肿瘤细胞增殖、诱导其凋亡并增加细胞对化疗的敏感性［19-20］。本研究显示，体外上调TU177细胞中miR-214表达后，细胞中Livin蛋白表达降低，并且双荧光素酶报告基因实验显示miR-214 能特异性靶向结合Livin 的3' UTR区，提示Livin是miR-214在LSCC中的靶向作用基因。

综上可见，miR-214 在LSCC 细胞中低表达；在体外，miR-214能够抑制Livin表达从而抑制LSCC细胞的增殖并促进其凋亡，这为LSCC 的靶向治疗提供了新的方向。