解偶联蛋白1敲除加剧异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌重构

郑 媛付鹤玲侯道荣尹 媛鲍 丹

(南京医科大学医药实验动物中心，南京 210000)

解偶联蛋白(uncoupling proteins，UCPs)是阴离子载体蛋白超家族的成员之一，位于线粒体内膜，参与线粒体膜电位的调控[1]。UCPs的发现，提出了质子泄漏学说[2]，即在正常情况下线粒体内膜存在一定程度的质子泄漏，使线粒体内膜的跨膜质子梯度减低，以致刺激线粒体呼吸的质子驱动力降低，使线粒体呼吸链氧化磷酸化解偶联，导致ATP数量减少，能量以热能的形式释放。研究发现，UCPs可减少线粒体氧化磷酸化过程中ROS的产生[3]。

UCP1，又称产热素，是第一个被发现的UCPs，主要在哺乳动物棕色脂肪组织(brown adipose tissue，BAT)中表达[4]。UCP1和(或)BAT被激活后，棕色脂肪细胞会消耗葡萄糖和脂质，将能量从葡萄糖和游离脂肪酸氧化转换成热量[5]。这种独特的代谢产热方式，使UCP1和BAT成为肥胖和2型糖尿病治疗的研究热点[6]。

本实验室的前期研究发现，UCP1在大鼠心脏组织中表达，并在异丙肾上腺素(isoproterenol，ISO)诱导的心肌重构模型[7]大鼠心脏组织中表达显著升高；Ucp1基因敲除导致心室壁和心收缩功能在ISO诱导的心肌重构急性期显著增加，但Ucp1基因敲除对心肌重构的长期影响仍未知。因此，本文旨在通过已建立的Ucp1基因敲除大鼠(Ucp1－/－)分析Ucp1基因敲除后对ISO诱导的心肌重构的长期影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物

本实验所用Ucp1－/－大鼠由中国医学科学院医学实验动物研究所制作，同时敲除大鼠培育过程中使用的SD大鼠均购自北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK(京)2019-0011]，大鼠饲养于南京医科大学医药实验动物中心屏障设施的饲养间[SYXK(苏)2020-0022]，饲养间温度(23±2)℃，12 h/12 h明/暗灯照，动物自由饮水和摄食。实验中所使用的实验动物为野生型(雌雄各6只)和Ucp1－/－(雌雄各6只)清洁级SD大鼠，8周龄，体重约250 g。实验中涉及动物操作程序均遵循3R原则并已取得南京医科大学实验动物福利伦理审查委员会的批准(IACUC-1704011)。

1.2 主要试剂与仪器

ISO(I6504)购自美国Sigma-Aldrich公司；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)生化检测试剂(990-63193)购自日本和光纯药工业株式会社；肌酸激酶同工酶MB(creatine kinase isoenzyme MB，CKMB)生化检测试剂(H007 T)购自中国美康生物科技股份有限公司；小动物超声(Vevo 2100)购自加拿大VisualSonics公司；全自动血生化分析仪(7100)购自日本日立公司。

1.3 实验方法

1.3.1 ISO诱导心肌重构大鼠模型

选用2月龄野生型(wild type，WT)大鼠和Ucp1－/－大鼠腹腔注射生理盐水或ISO(30 mg/(kg·d)，连续3 d)建立大鼠心肌重构模型。大鼠随机分成4组:WT生理盐水组、Ucp1－/－生理盐水组、WTISO组和Ucp1－/－-ISO组(n＝6)。

1.3.2 M型超声心动图检测大鼠心脏的形态结构和功能

于生理盐水或ISO注射后1个月，分别对4组大鼠进行M型超声心动图检测。大鼠经1.5%异氟烷气体麻醉，脱胸前区被毛，仰卧固定于加热板上，以保持体温，四肢固定，选用MS250的探头，进行心脏超声影像分析[8]。

1.3.3 大鼠血清中CK-MB和LDH水平的检测

于生理盐水或ISO注射后1个月，大鼠经4%异氟烷气体麻醉，打开腹腔，钝性分离暴露腹主动脉，从腹主动脉分别采集4组大鼠3 mL外周血，室温放置1 h后，3000 r/min，4℃离心10 min，获取血清。利用全自动血生化分析仪测定LDH和CK-MB水平。

1.3.4 病理组织学观察大鼠的心肌细胞形态和间质纤维化

于生理盐水或ISO注射后1个月，二氧化碳法处死大鼠，打开胸腔取出心脏，将心脏组织固定在中性福尔马林24 h后进行修块、脱水、包埋、切片、苏木素-伊红(haematoxylin-eosin，HE)染色和Masson染色，镜下观察。

1.4 统计学方法

实验数据以平均数±标准差(±s)表示，数据运用SPSS 16.0统计学软件处理分析。如果数据符合正态分布，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行组间比较，若组间差异有统计学意义，进一步采用Tukey’s post-hoc检验，P<0.05认为有统计学意义。

2 结果

2.1 Ucp1基因敲除加剧了ISO诱导的急性心肌缺血模型大鼠左心室的不利重构

于生理盐水或ISO注射后1个月，分别对4组大鼠进行M型超声心动图检测。结果显示，生理盐水组，与WT大鼠相比，Ucp1－/－大鼠左心室收缩末期后壁厚度显著减小了11.63%(P<0.01，图1A)，左心室内径呈增大且心收缩功能下降的趋势。ISO组WT大鼠左心室收缩末期前壁厚度显著增加了37.07%(P<0.001)，说明WT大鼠仍处于ISO诱导的室壁肥厚代偿期；而Ucp1－/－大鼠左心室收缩末期前壁厚度未显著增加，且与WT大鼠相比，Ucp1－/－大鼠左心室收缩末期前壁厚度显著减小了14.10%(P<0.05，图1B)，说明Ucp1－/－大鼠已由代偿期向失代偿期转换。再者，ISO的诱导导致WT大鼠和Ucp1－/－大鼠左心室射血分数均显著降低(P<0.01，P<0.001)，且Ucp1－/－大鼠的左心室射血分数显著低于WT大鼠(P<0.05)，说明Ucp1基因敲除显著加剧了ISO诱导的心收缩功能减退(图1C~H)。

图1 ISO诱导后1个月WT和Ucp1－/－大鼠心脏M型超声心动图分析Figure 1 M-mode echocardiography analysis of WT and Ucp1－/－rats at 1 month after ISO administration

2.2 Ucp1基因敲除升高了ISO诱导的急性心肌缺血模型大鼠血清中心肌损伤标志物水平

于生理盐水或ISO注射后1个月，分别对4组大鼠进行血清LDH和CK-MB水平的检测。结果显示，生理盐水组，与WT大鼠相比，Ucp1－/－大鼠血清LDH水平显著升高(P<0.05，图2A)。ISO组与生理盐水组相比，WT和Ucp1－/－大鼠血清LDH水平均显著升高(P<0.05，图2A)；Ucp1－/－大鼠血清CKMB水平显著升高(P<0.01，图2B)。此外，ISO注射后1个月，Ucp1－/－大鼠血清LDH和CK-MB水平均显著高于WT大鼠(P<0.01，P<0.05，图2B)。

图2 ISO诱导后1个月WT和Ucp1－/－大鼠血清中心肌损伤标志物水平检测Figure 2 Serum marker of myocardial injury analysis of WT and Ucp1－/－rats after ISO administration 1 month

2.3 Ucp1基因敲除加剧了ISO诱导的急性心肌缺血模型大鼠的病理组织学表型

于生理盐水或ISO注射后1个月，分别对4组大鼠进行心脏病理组织学表型分析。结果显示，生理盐水组，WT大鼠和Ucp1－/－大鼠心肌细胞排列和间质纤维化程度无显著差别。ISO组与WT大鼠相比，Ucp1－/－大鼠心肌细胞排列紊乱(图3A、B)和间质纤维化(图3C)程度更加严重。

图3 ISO诱导后1个月WT和Ucp1－/－大鼠病理组织学表型分析Figure 3 Histopathological phenotyping analysis of WT and Ucp1－/－rats after ISO administration 1 month

3 讨论

在对ISO诱导的大鼠心肌重构模型的长期观察过程中，本研究发现，Ucp1基因敲除显著加剧了ISO诱导的大鼠心脏的病理进程发展。具体表现为:ISO诱导后1个月，与WT大鼠相比，Ucp1－/－大鼠左心室室壁厚度显著变薄、射血分数显著降低；血清中心肌损伤标志物LDH和CK-MB水平显著增高；心肌细胞排列紊乱和间质纤维化程度更加严重。

UCP1主要在哺乳动物BAT中表达。心肌细胞损伤发生后，交感神经激活，去甲肾上腺素释放[9]，合并利尿肽释放[10]，这些分子均是BAT生长和激活的重要影响因子。ISO是β肾上腺素能受体的一种非选择性的激动剂，被广泛地运用于心肌肥厚和心力衰竭的动物模型的构建[11]。ISO诱导的动物模型心脏组织的病理学和形态改变被认为是最接近临床上心脏病人的体征的。因此，本研究选用ISO构建大鼠心肌重构模型以及前期建立的Ucp1－/－大鼠来明确Ucp1基因敲除对缺血性心脏疾病的长期影响是具有理论支撑和科学可行性的。

本研究发现，Ucp1基因敲除后，生理盐水组，与WT大鼠相比，Ucp1－/－大鼠血清LDH水平显著升高，说明Ucp1基因敲除在生理状况下可能对心肌就存在一定的损伤刺激；此外，Ucp1基因敲除后，ISO诱导的大鼠心肌重构长期病理表型亦显著加剧，上述表型改变可能跟Ucp1基因敲除后BAT功能障碍相关。已有研究证实BAT的生物学功能受Ucp1的调控[12]，Ucp1－/－小鼠BAT激活能力受损[13]。此外，现有研究发现，BAT及其相关组织还具有调节多种心血管风险因子的功能。血管周周和心外膜脂肪组织(类似BAT[14])参与动脉粥样硬化和血压的调节[15]。体外稳转Ucp1的H9C2细胞可抵抗缺氧/再氧化的损伤，提高心肌细胞的存活率，保留线粒体正常的结构和功能，减少缺氧后ROS的产生[16]；转基因过表达Ucp1的小鼠也可抵抗缺血/再灌注的损伤，显著改善再灌注阶段心功能的恢复[17]。现有研究结果和本研究结果从正反两方面共同验证了UCP1的心脏保护性作用，但其潜在的分子机制仍需大量的后续研究证实。

综上所述，Ucp1基因敲除会加剧ISO诱导的心肌重构的长期病理表型，增加UCP1的表达对缺血性心脏病具有保护作用，这为临床上防治药物的研发提供了理论和实验依据。