雷帕霉素的水解行为及对4 种非靶标生物的急性毒性

杨石有, 董师旭, 史儒松, 蒲金基,董金皋, 刘颖超*,, 张 贺*,

(1. 河北农业大学 植物保护学院，河北 保定 071001；2. 海南大学 林学院，海口 570228；3. 中国热带农业科学院 环境与植物保护研究所，海口 571101；4. 河北农业大学 河北省植物生理与分子病理学重点实验室，河北 保定 071001)

雷帕霉素 (rapamycin) 又名西罗莫司 (Sirolimus)，最早是从吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus中分离获得的一类三十六元环的含氮三烯大环内酯类次级代谢产物，具有良好的抑制真菌[1]和肿瘤[2]的活性，同时也是很强的免疫抑制剂[3]。雷帕霉素靶蛋白mTOR 是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白，普遍存在于真核生物体内，其靶标TOR 蛋白激酶通过对蛋白质的合成及其稳定性以及对转录因子的调控而抑制真菌和肿瘤细胞的生长[4-5]，甚至可通过自我吞噬作用诱导细胞程序性死亡而调控真核细胞的生长[6]。现有研究发现：雷帕霉素可延长小鼠寿命[7]；有效阻断癌细胞的扩散和发展，在某些小鼠机体中，雷帕霉素甚至可加速肿瘤的消亡[8]；可预防糖尿病及相关心脏并发症[9]；对血液疾病具有一定的治疗作用[10]。

相对于医学领域，关于雷帕霉素在农业方面的研究较少，但随着研究的深入，已发现雷帕霉素对害虫及植物病原菌具有较好的生物活性。李佳芮等[11]研究发现，雷帕霉素可提高斜纹夜蛾Spodoptera litura的自噬水平。经雷帕霉素处理后，禾谷镰孢Fusarium graminearum菌丝膨大扭曲，隔膜变多，菌丝内脂肪体积累[12]。Meléndez 等[13]发现，雷帕霉素对番茄灰霉病菌Botrytis cinerea具有明显拮抗活性。王彦等[14]的研究表明，雷帕霉素对油菜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum、水稻纹枯病菌Rhizoctonia solani和棉花枯萎病菌Fusarium oxysporum具有较好的抑制活性，扫描电镜观察发现，经雷帕霉素处理后，菌丝表现出提前衰老等症状。魏宁等[15]研究发现，雷帕霉素对玉米大斑病菌Setosphaeria turcica分生孢子萌发、附着胞形成及穿透能力均有不同程度的抑制作用。吕秀兰等[16]将雷帕霉素与甲霜·噁霉灵复配，发现其对马铃薯早疫病菌Alternaria solani具有较好的抑制作用。

农药在施用过程中不可避免地会出现飘移、流失等现象[17]，进入环境中的农药，除了会对土壤和水体造成污染外，还可能引起非靶标生物的中毒或死亡。农药的环境行为是评价其在环境中残留特性的重要指标[18]，研究农药在环境中的降解和归趋，对于科学使用农药，减少环境污染和降低对非靶标生物的危害具有重要意义[19]。

农药对非靶标生物的安全性评价是新农药开发与应用中必不可少的环节，不仅可为新农药的登记提供基础毒理学数据，还可为其科学合理使用提供理论依据与指导[20]。雷帕霉素作为极具潜力的生物源农药，随着相关研究的深入，将会在农业领域得到越来越多的应用，而目前关于其环境行为及对非靶标生物的安全性还未见报道。因此，本研究模拟自然环境条件，研究了不同pH 值、初始浓度、光源对雷帕霉素水解的影响，同时参照《化学农药环境安全评价试验准则》方法，开展了雷帕霉素原药对家蚕、意大利工蜂、斑马鱼及赤子爱胜蚯蚓4 种非靶标生物的急性毒性试验，以期为其科学合理使用及环境风险评价提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

Chromaster 高效液相色谱仪，带紫外检测器(日立高新技术公司)；AB135-S 万分之一电子天平(广州君达仪器公司)；KQ-250DE 超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；RE5003 旋转蒸发仪(郑州华特仪器设备有限公司)；SW-CJ-2FD 垂直超净工作台 (科锐特洁净科技有限公司)；GR60DA自动压力蒸汽灭菌锅 (上海诺顶仪器设备有限公司)；PQX-250 智能人工气候箱 (常州市仪都仪器有限公司)；HH-6 数显恒温水浴锅 (上海高致精密仪器有限公司)。

雷帕霉素 (rapamycin) 标准品 (98%，北京索莱宝科技有限公司)；二氯甲烷、二甲基亚砜、丙酮、氯化钠、乙酸、乙酸钠、磷酸二氢钠、氢氧化钠、碳酸氢钠、碳酸钠均为分析纯；乙腈为色谱纯。

1.2 供试生物

家蚕Bombyx mori，品种为菁松 × 皓月，卵块购于山东广通蚕种集团有限公司，采用常规方法催青，于 (25 ± 2) ℃、相对湿度70%～85%恒温人工气候箱中饲养。意大利工蜂Apis melliiferaL.，购于海南省儋州市那大镇养蜂场。斑马鱼Brachydanio rerio，购于海南省儋州市那大镇花鸟市场，体长约3 cm，于实验室驯化7 d，挑选健康活泼、大小一致的幼鱼进行试验，试验前24 h 停止喂食。赤子爱胜蚯蚓Eisenia foetida，购于天津贾立明蚯蚓养殖中心，于室温20 ℃条件下避光驯养，挑选已出现繁殖环带的健康成年蚯蚓供试。

1.3 标准溶液配制及标准曲线绘制

准确称取0.025 g (精确至0.000 1 g) 雷帕霉素标准品，用丙酮溶解并定容至50 mL，配成质量浓度为500 mg/L 的母液，置于 -20 ℃冰箱避光保存。试验时再用丙酮稀释至2.5～50 mg/L，采用高效液相色谱仪 (HPLC) 进行测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

1.4 液相色谱检测条件

色谱柱：Amethyst C18-H (4.6 mm × 250 mm，5 μm)；流动相：V(乙腈) :V(水) = 90 : 10；检测波长278 nm；柱温40 ℃；流速1.0 mL/min；进样量10 μL。在此条件下，雷帕霉素保留时间为5.313 min。

1.5 雷帕霉素的水解行为研究

1.5.1 雷帕霉素在不同pH 值缓冲溶液中的水解

不同pH 值缓冲溶液配制参照程功等[21]的方法。分别用灭菌后pH 值为5、7、9 的缓冲溶液将雷帕霉素母液配制成 10 和50 mg/L 的溶液，搅拌均匀后分装于棕色容量瓶中，置于25 ℃恒温培养箱中避光保存，每处理重复3 次。分别于4、8、12、24 h 和2、4、6、8、10 d 取样检测，考察雷帕霉素在不同pH 值缓冲溶液中的水解情况。

1.5.2 雷帕霉素在不同温度下的水解 用无菌水将雷帕霉素母液配制成 10 和50 mg/L 的溶液，搅拌均匀后分装于棕色容量瓶中，分别置于25 和50 ℃恒温水浴锅中避光保存，每处理重复3 次。分别于4、8、12、24 h 和2、4、6、8、10 d 取样检测，考察雷帕霉素在不同温度下的水解情况。

1.5.3 雷帕霉素在不同光源中的水解 用无菌水将雷帕霉素母液配制成 10 和50 mg/L的溶液，搅拌均匀后分装于白色容量瓶中，分别置于窗边自然光照和超净工作台中距紫外灯10 cm处 (辐射照度为3.00 mW/cm2，额定功率为8 W × 2)，每处理重复3 次。分别于4、8、12、24 h 和2、4、6、8、10 d 取样检测，考察雷帕霉素在不同光源中的水解情况。

1.5.4 样品前处理 将各处理样品分别置于分液漏斗中，加入10 mL 二氯甲烷和1.0 g 氯化钠晶体，充分振荡3 min，静置分层，取下层有机相；重复提取1 次。合并有机相于旋转蒸发仪中，40 ℃浓缩至1 mL 左右，加入色谱纯乙腈溶解，转移至棕色容量瓶中，用乙腈定容至10 mL，过0.45 μm滤膜后采用 HPLC 测定。

1.6 雷帕霉素对4 种非靶标生物的急性毒性测定

1.6.1 雷帕霉素对家蚕的急性毒性试验 参照《化学农药环境安全评价试验准则 第11 部分：家蚕急性毒性试验》[22]，采用浸叶法处理。在预试验基础上，将雷帕霉素母液用自来水分别稀释为1 000、500、200、100 和50 mg/L 5 个质量浓度，将新鲜干净的桑叶置于各浓度药液中浸渍10 s，取出晾干后放入垫有滤纸、直径 12 cm 的培养皿中，每皿分别接入20 头2 龄起蚕。每处理重复3 次。以清水和加体积分数0.5%二甲基亚砜的水溶液为对照。处理后置于 (25 ± 2) ℃、相对湿度70%～85%恒温人工气候箱内饲养，分别于24、48、96 h 观察家蚕的中毒症状及死亡情况，计算96 h-LC50值。家蚕的中毒症状参照陈伟国等[23]所用的方法进行评价。

1.6.2 雷帕霉素对意大利工蜂的急性毒性试验

参照《化学农药环境安全评价试验准则 第10 部分: 蜜蜂急性毒性试验》[24]方法进行。

急性经口毒性：用50%的蔗糖水溶液将雷帕霉素母液稀释为1 000、500、250、125 和62.5 mg/L 5 个质量浓度，取200 μL 分别加入饲喂器(离心管) 并称重。每个蜂笼接入10 头蜂，3 h 后取出饲喂器并称重，记录每组药液的消耗量。之后饲喂不含药液的50%蔗糖水溶液。以50%蔗糖水溶液和含体积分数 0.1%二甲基亚砜的水溶液为对照，每处理重复3 次。将试验蜂笼置于黑布遮盖的饲养架上，分别于24 和48 h 观察记录意大利工蜂的中毒症状和死亡数，计算48 h-LD50值。

急性接触毒性：用丙酮将雷帕霉素母液分别稀释为50、25、12.5、6.25 和3.125 mg/mL 5 个质量浓度，用微量点滴仪吸取1.0 μL 各浓度药液点滴于意大利工蜂中胸背板上。待药液晾干后转入蜂笼中，用50%蔗糖水饲喂。以点滴1.0 μL 丙酮的处理为空白对照，每处理重复3 次，每重复10 头蜂。分别观察记录24 及48 h 时意大利工蜂的中毒症状和死亡数，计算48 h-LD50值。

1.6.3 雷帕霉素对斑马鱼的急性毒性试验 参照《化学农药环境安全评价试验准则 第12 部分: 鱼类急性毒性试验》[25]，采用半静态法进行。将雷帕霉素母液用脱氯的自来水分别配制成20、10、5、2.5 和1.25 mg/L 系列质量浓度的药液。斑马鱼在室内驯养7 d 后，挑选体长大小一致、健康活泼的幼鱼，分别饲养于不同浓度药液中，以曝气并加入相同体积溶剂的自来水为空白对照，每处理重复3 次，每重复10 条斑马鱼。于试验开始后 6 h内随时观察记录受试鱼的中毒及死亡情况，之后在24、48、72 及96 h 分别继续观察其中毒及死亡情况，及时清除死鱼，计算96 h-LC50值。试验体系药液体积为5 L，试验周期为96 h，每隔24 h更换原有全部药液，并测定试验体系的pH 值、温度及溶解氧含量 (DO)，以保持试验条件稳定。

1.6.4 雷帕霉素对赤子爱胜蚯蚓的急性毒性试验

参照《化学农药环境安全评价试验准则 第15 部分：蚯蚓急性毒性试验》[26]，采用土壤接触法进行。将雷帕霉素母液用蒸馏水分别配成3 000、2 000、1 000、500 及250 mg/L 系列质量浓度的药液，分别取100 mL 不同质量浓度的雷帕霉素药液与500 g 土样混合并充分搅拌，加蒸馏水调节土壤含水量至30%～35%，使毒土中雷帕霉素的质量分数分别为600、400、200、100 和50 mg/kg。将土样装入标本瓶中，用纱布封口，每处理重复3 次，每重复放入10 条蚯蚓。将标本瓶置于(20 ±1) ℃、相对湿度80%～ 85%的培养箱中培养。分别于第7 天和第14 天倒出瓶内土壤，观察记录蚯蚓的中毒及死亡情况，及时清除死蚯蚓，计算14 d-LC50值。

1.7 数据处理

雷帕霉素在不同条件下的水解按照一级反应动力学方程Ct=C0e-kt进行拟合。消解半衰期 (t1/2) 按t1/2= ln2/k计算；温度效应系数 (Q) 按Q=k(t+10)/kt计算；其中：Ct为t时刻雷帕霉素的质量浓度(mg/L)；C0为雷帕霉素初始质量浓度 (mg/L)；k为消解速率常数 (h-1)。

采用SPSS 19.0 统计软件中的Probit 回归方法计算雷帕霉素对4 种非靶标生物的急性毒性LC50(LD50) 值，并通过Duncan 氏新复极差法检验对试验结果进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 检测方法的验证

采用外标法进行定量。结果表明，在2.5～50 mg/L 范围内，雷帕霉素的峰面积与进样质量浓度间具有良好的线性关系，回归方程为y= 15 054x-5 350.1，相关系数r为0.999 9。在1、10 和50 mg/L添加水平下，平均回收率在89%～96%之间，相对标准偏差 (RSD) 在1.3%～2.4%之间，仪器检出限(LOD) 为0.027 mg/L，定量限 (LOQ) 为0.09 mg/L，雷帕霉素与其他杂质分离较好，表明所用方法可满足雷帕霉素定量检测要求，相关谱图见补充材料附图1 和附图2。

2.2 雷帕霉素在不同条件下的水解动态

2.2.1 雷帕霉素在不同pH 值下的水解 结果 (表1)表明：雷帕霉素在不同pH 值缓冲溶液中的水解存在一定差异，碱性条件下更有利于其水解；相同pH 值条件下，则初始浓度越高，半衰期越长。

表1 雷帕霉素在不同pH 值条件下的水解动力学参数Table 1 Hydrolysis kinetics parameters of rapamycin under different pH values

2.2.2 雷帕霉素在不同温度下的水解 结果 (表2)

表2 雷帕霉素在不同温度下的水解动力学参数Table 2 Hydrolysis kinetics parameters of rapamycin under different temperatures

表明：雷帕霉素在不同温度下的水解存在一定差异。相同初始浓度下，温度越高其水解速度越快；相同温度条件下，则初始浓度越高，水解速度越慢。雷帕霉素的水解速度可用温度效应系数(Q) 进行评价，Q值越大，水解越快。

2.2.3 雷帕霉素在不同光源下的水解 结果 (表3)表明：雷帕霉素在不同光源下的水解也存在一定差异。相同初始浓度下，雷帕霉素在紫外光条件下的水解速度较自然光下快，初始质量浓度为10 mg/L 的雷帕霉素在自然光下的半衰期是紫外光下的1.98 倍；相同光源下，则初始浓度越高，水解速度越慢，紫外光下，初始质量浓度为50 mg/L的雷帕霉素的半衰期是10 mg/L 时的2.7 倍。

表3 雷帕霉素在不同光源下的水解动力学参数Table 3 Hydrolysis kinetics parameters of rapamycin under different light sources

2.3 雷帕霉素对4 种非靶标生物的急性毒性

测定结果 (表4)表明，雷帕霉素对4 种非靶标生物的急性毒性存在一定差异，其中对家蚕、赤子爱胜蚯蚓及意大利工蜂的急性接触毒性表现为 “低毒”，对斑马鱼和意大利工蜂的急性经口毒性表现为 “中毒”。

表4 雷帕霉素对4 种非靶标生物的急性毒性Table 4 Acute toxicity of rapamycin to four non-target organisms

2.3.1 雷帕霉素对家蚕的急性毒性 2 龄家蚕经不同浓度雷帕霉素处理后，其中毒症状存在一定差异：低浓度处理组与对照组无明显差异，高浓度组家蚕出现头部翘起、体缩、吐液症状。处理后24 h 与对照组无明显差异，48 h 后出现中毒症状及少量死亡现象，96 h 后处理组家蚕多数出现体缩、吐液及死亡现象。对存活的家蚕继续饲喂健康叶片，观察发现雷帕霉素对家蚕生长发育具有一定的延缓作用。雷帕霉素对家蚕的24、48、72 及96 h LC50值见补充材料附表1。随着染毒时间延长，雷帕霉素对家蚕的毒性逐渐升高，不同染毒时间之间LC50值差异达显著水平。雷帕霉素对家蚕的 96 h-LC50值为有效成分386.46 mg/L，根据试验准则中农药对家蚕的毒性等级划分标准[22]，可知雷帕霉素对家蚕的急性毒性等级为 “低毒”。

2.3.2 雷帕霉素对意大利工蜂的急性毒性 分别测定了雷帕霉素对意大利工蜂的急性经口和接触毒性。处理后24 h，低浓度组未出现中毒和死亡现象，高浓度组部分蜂出现抽搐、死亡现象；48 h 后，低浓度组部分蜂出现中毒症状，有少量死亡，高浓度组大部分意大利工蜂死亡，死亡蜂体表现为腹部弯曲变黑、展翅现象。雷帕霉素对意大利工蜂的24、48 h 急性经口和接触毒性LD50值见补充材料附表2。随着染毒时间延长，雷帕霉素对意大利工蜂的毒性逐渐升高，不同染毒时间之间LD50值差异达显著水平。雷帕霉素对意大利工蜂的48 h 急性经口毒性LD50值为有效成分8.95 μg/bee，48 h 急性接触毒性LD50值为有效成分16.79 μg/bee，根据试验准则中农药对蜜蜂的毒性等级划分标准[24]，可知雷帕霉素对意大利工蜂的急性经口毒性等级为 “中毒”，急性接触毒性等级为 “低毒”。

2.3.3 雷帕霉素对斑马鱼的急性毒性 斑马鱼在不同浓度雷帕霉素药液中的中毒程度和死亡率与药剂浓度呈正相关，药剂浓度越高，中毒症状出现越早，症状越明显。高浓度 (20 mg/L) 组斑马鱼逐渐表现出反应迟缓、游速减慢、鳃部发红、侧游等中毒症状，低浓度处理组则反应不明显；随着染毒时间延长，高浓度组斑马鱼死亡数逐渐增多，死亡斑马鱼表现为鱼体发白、腹部肿大、鱼鳍张开、腮部淤血等症状，并沉于水底。雷帕霉素对斑马鱼的24、48、72 及96 h LC50值见补充材料附表3。随着染毒时间延长，雷帕霉素对斑马鱼的毒性逐渐升高，不同染毒时间之间LC50值差异达显著水平。雷帕霉素对斑马鱼的96 h-LC50值为有效成分3.50 mg/L，根据试验准则中农药对鱼类的毒性等级划分标准[25]，雷帕霉素对斑马鱼的急性毒性等级为 “中毒”。

2.3.4 雷帕霉素对赤子爱胜蚯蚓的急性毒性 赤子爱胜蚯蚓的死亡率与药剂浓度和染毒时间呈正相关，随着药剂浓度升高和染毒时间延长，蚯蚓的死亡率逐渐升高。低浓度雷帕霉素对赤子爱胜蚯蚓影响不大，高浓度处理组蚯蚓出现黄色体液渗出、局部肿大溃烂、环带膨大等中毒症状，对照组未出现死亡情况。雷帕霉素对蚯蚓的7 d 和14 d LC50值见补充材料附表4。随着染毒时间延长，雷帕霉素对蚯蚓的毒性逐渐升高，不同染毒时间之间LC50值差异达显著水平。雷帕霉素对蚯蚓的14 d-LC50值为有效成分223. 81 mg/kg (干土)，根据试验准则中农药对蚯蚓的毒性等级划分标准[26]，雷帕霉素对赤子爱胜蚯蚓的急性毒性等级为 “低毒”。

3 结论与讨论

农药的环境行为研究及对非靶标生物的安全性评价是新农药登记的必备材料，也是评价农药环境安全性的重要依据。本实验室前期研究结果表明，雷帕霉素对芒果炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides、拟轮枝镰孢Fusarium verticillioides及水稻稻瘟病菌Magnaporthe oryzae的抑制活性明显高于市售的常见杀菌剂 (数据未发表)。雷帕霉素作为极具潜力的生物源农药，开展其水解行为研究及对非靶标生物的安全性评价具有重要的意义。本研究发现，雷帕霉素在不同环境条件下的水解速度存在差异：在不同pH 值条件下其水解速度依次为pH 9＞pH 7＞pH 5；相同初始浓度下，温度越高水解速度越快，相同温度下，则初始浓度越高水解速度越慢；相同初始浓度下，其在紫外光下的水解速度较自然光下快，相同光源下，则初始浓度越高水解速度越慢。根据不同环境条件下的半衰期判断，雷帕霉素属于易降解性药剂。对4 种非靶标生物的急性毒性试验结果表明，雷帕霉素对家蚕及赤子爱胜蚯蚓 “低毒”，对斑马鱼为 “中毒”，对意大利工蜂的经口毒性为“中毒”、接触毒性为 “低毒”。

水解是农药的主要环境化学行为，包括农药在水环境中的微生物降解、化学降解与光降解，是评价农药在水体中残留特性的重要指标[27]。农药的水解除与药剂自身性质有关外，还与水体pH 值、温度、水质、光源、初始浓度、有机溶剂、光敏剂、光猝灭剂、催化剂和氧化剂等因素有关[28]。水体的酸碱性是影响农药水解的重要因素之一，溶液中的H+和OH-均可催化农药的水解。农药自身结构、性质不一样，在不同酸碱性缓冲溶液中的水解速度也不一样。张双等[28]发现2,4-滴异辛酯在酸性环境中降解较快，而程功等[21]发现丙炔氟草胺 (flumioxazin) 在碱性环境中降解较快。本研究中雷帕霉素的水解速度与溶液pH 值呈正相关，这与同为大环内脂类抗生素的阿维菌素 (abamectin) 在不同pH 值条件下的降解行为一致[29]，这可能是由于碱性条件下大量OH-促进了雷帕霉素的反应，从而导致其水解加快。在一定温度范围内，随温度升高，化学反应的活化能(Ea) 增大，反应速率加快，从而导致水解速度加快，本研究中雷帕霉素的水解速度随着温度的升高而加快，这也与阿维菌素原药在不同水温中的降解行为一致[29]。光照是农药降解的重要因素之一，当光源的辐射波长与药剂自身的最大吸收波长相近时，药剂的降解速度较快。本研究中雷帕霉素在紫外光下的水解速度快于自然光下，这可能与雷帕霉素最大吸收波长 (277 nm)[30]与紫外灯的辐射波长 (254 nm) 相适应有关，这也与阿维菌素原药的光降解结果一致[31]。由于本研究中选用白色玻璃容量瓶盛放药液，对紫外光有一定的阻隔作用，因此雷帕霉素在紫外光中的水解特性还有待进一步研究。

家蚕、蜜蜂、斑马鱼及蚯蚓是农药环境安全性评价研究常用靶标对象。目前有关农药对家蚕的毒性研究主要集中在急性毒性和中毒症状观察方面。本研究发现，低浓度雷帕霉素处理组家蚕和空白对照无明显差异，高浓度处理组家蚕出现吐液、头部翘起、身体缩短等中毒症状，与文献报道的症状[32]一致。同时测得雷帕霉素对家蚕的96 h-LC50值为386.46 mg/L，对家蚕的急性毒性为“低毒”，结果与新奥霉素 (xinaomycin) 对家蚕的急性毒性一致[33]，但同为大环内脂类抗生素的阿维菌素对家蚕的急性毒性却表现为 “剧毒”[32]，这可能与二者的防治对象差异有关。近年来，有关农药对家蚕的慢性毒性也逐渐引起了人们的关注，慢性毒性虽不足以导致家蚕短时间内中毒死亡，但随着摄入量的积累，会对家蚕生长发育、生理代谢和经济性状如眠蚕体重、全茧量、茧层量、茧层率、结茧率和化蛹率等产生影响[34-35]。本研究中观察发现，雷帕霉素可使家蚕的发育历期延长，但并未对其经济学性状进行评价，后续还需进一步研究。本研究发现雷帕霉素对意大利工蜂的急性经口毒性为 “中毒”，急性接触毒性为 “低毒”，与张宝兰等[36]发现阿维菌素对意大利工蜂的急性经口毒性为 “高毒” 存在一定差异，其原因可能也与二者的防治对象不同有关。贾伟等[37]研究发现，相同有效成分、不同剂型的农药对斑马鱼的毒性不同，嘧菌酯 (azoxystrobin) 原药的急性毒性大于水分散粒剂，啶氧菌酯 (picoxystrobin) 悬浮剂的急性毒性大于原药，这可能与制剂中的助剂及溶剂有关。本研究中采用二甲基亚砜作助溶剂，发现其对斑马鱼无影响，观察发现，斑马鱼在高浓度雷帕霉素中反应较为迅速，随着染毒时间延长，出现腹部肿大、鱼鳍张开、腮部淤血等中毒症状。蚯蚓对环境变化较为敏感，且对有机及无机污染物具有富集作用，常作为模式生物用于研究土壤生态环境变化。经高浓度雷帕霉素处理后，赤子爱胜蚯蚓出现黄色体液渗出、局部肿大溃烂、环带膨大等中毒症状，低浓度处理组则中毒症状不明显。本研究表明，雷帕霉素对赤子爱胜蚯蚓为 “低毒”，这与阿维菌素、伊维菌素对赤子爱胜蚯蚓的急性毒性结果一致[38]。

综上所述，雷帕霉素属于易降解性药剂，因此在今后的剂型开发中应以可控释、缓释的微胶囊等制剂为主；雷帕霉素对斑马鱼和意大利工蜂的急性经口毒性为 “中毒”，在药剂施用时应尽量远离河道和避开花期。虽然目前雷帕霉素尚未作为商品农药使用，但大量文献研究结果[11-16]表明，其作为一种生物源农药开发的潜力巨大。开展雷帕霉素的水解行为和对非靶标生物的毒性研究将有助于更好地了解其在水体中的降解行为、环境归趋和对非靶标生物的安全性，为雷帕霉素药剂的合理开发及安全使用提供重要参考。