应用iTRAQ技术鉴定糖尿病痛性神经病变血清蛋白 标志物

田佳佳，李鹏，陈华永

(潍坊市益都中心医院，山东 潍坊 262500)

0 引言

糖尿病痛性神经病变(Diabetic Peripheral Neuropathy Pain，DPNP)是一种常见的糖尿病周围神经病变并发症，在临床上以痛觉过敏和自发痛为主要的表现，会严重影响患者的生活质量。近几年的研究认为，DPNP的发生是多种细胞因子、蛋白质和信号传导通路共同作用的结果。但是，目前在临床上针对DPNP没有有效的治疗手段，非甾体类抗炎止痛药物和阿片类麻醉药物只能暂时的缓解症状，并且会带来大量的副作用[1]。iTRAQ技术一种能够对多组样本同时进行分析的蛋白组学技术，结合液相色谱和串联质谱技术已经成为蛋白质组学技术研究的主要工具，广泛的用于各种生物学标志物的寻找。本实验旨在利用iTRAQ技术筛选糖尿病痛性神经病变患者血清中发生差异表达的蛋白质，联合生物信息学分析差异表达的蛋白质，从而为进一步研究糖尿病痛性神经病变的发病机制提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

MALDI-TOF/TOF质谱仪、Nano-Tempo LC点靶仪、iMark型酶标仪、Agilent 1200 series液相色谱仪；iTRAQBuffer试剂盒、胰酶、Multiple Affinity Removal System (MARS) Human 14亲和层析柱。

1.2 样本采集及分组

选取2020年3到至2021年3月在潍坊市益都中心医院内分泌科住院的100例2型糖尿病患者。按照2013年中华医学会糖尿病学分会制定的T2DM诊断标准和2009年美国糖尿病学会共识声明中的DPN诊断标准，将2型糖尿病患者分为2组，A组：单纯糖尿病组，50例；B组：糖尿病痛性神经病变组，50例。

诊断标准：(1)2013年中华医学会糖尿病学分会制定的T2DM、DPNP；(2)2009年美国糖尿病学会共识声明中有关DPNP的诊断标准。

排除标准：患有糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变等微血管病变；患有严重高血压和心脑血管疾病；感染性疾病；恶性肿瘤；自身免疫性疾病；正在接受抗生素治疗的患者；吸烟，饮酒有精神类药物的滥用病史的患者；妊娠和哺乳期患者；其他原因引起周围神经痛的患者。

血液采集经过医院伦理委员会批准并征得患者本人或者家属的同意，每日清晨空腹抽取静脉血5mL于促凝管内，分别记为糖尿病组和糖尿病痛性神经病变组，在室温中放置30min，使用4℃恒温离心机3000r/min离心20min，分离上层血清，放置于-80℃冰箱保存。

1.3 高丰度蛋白的去除

把-80℃冰箱保存的血清在冰上复溶，各组的50例样本分别取5μL进行等体积的混合，然后应用MARS HUMAN-14免疫亲和色谱柱去掉在血清中高表达的白蛋白、IgG、转铁蛋白等14种蛋白。剩下的低丰度蛋白使用离心浓缩器浓缩，并测定蛋白的浓度。

1.4 使用胰酶酶解和进行标记

每一组样本取100μg蛋白，进行变性、还原、半胱氨酸修饰和胰酶酶解等前期处理，然后使用iTRAQ试剂对糖尿病组和糖尿病痛性神经病变组分别进行标记。

1.5 质谱分析

完成标记的酶解多肽混合物首先进行脱盐，再使用液相色谱仪进行色谱分离，分离完成后使用第二维反相色谱分离并点靶。点靶完成后使用质谱仪进行质谱分析。

1.6 数据分析

数据分析使用ProteinPilot软件，在人类IPI蛋白质数据库中进行搜索。选择可信度区间≧95%或者Protscore≧1.3的蛋白进行认定，把113为对照组，比值≧1.5或者≦0.67作为阈值筛选差异蛋白。使用DAVID对鉴定得到的差异蛋白质进行功能注释，其中选择GO(gene ontology)的生物过程、细胞成分和分子功能注释对蛋白进行分类，在KEEG的通路数据库中对差异表达的蛋白质进行分类和通路富集分析。

2 结果

2.1 质谱鉴定结果

数据利用Protein Pilot软件搜索得到可信度大于95%的蛋白170种，差异表达的蛋白23种，较糖尿病组表达上调的蛋白有16种，下调的蛋白质7种，见表1。

表1 两组比较，上调或者下调差异1.5倍以上的蛋白质

2.2 生物学功能分析

对糖尿病痛性神经病变患者发生差异表达的23种蛋白质进行基因功能聚类分析以及通路的分类和富集分析后发现这23种蛋白主要参与了炎症级联反应、激活补体系统、细胞凋亡过程、蛋白酶类的水解等生物学过程；细胞组分主要包括细胞膜结合蛋白、核蛋白复合体、免疫攻击复合物等；分子功能主要为结合催化功能；富集到的信号通路主要是多种细胞因子介导的炎症信号通路、凝血级联反应等。

3 讨论

随着对糖尿病痛性神经病变研究的进一步深入，发现不论是神经的异常放电、神经生长因子的改变或者是神经的中枢敏化等作用大都能够转归到各种细胞因子引起的炎症反应上，了解这些细胞因子的信号通路和作用对象对更加深入的了解和阐释糖尿病痛性神经病变的发生机制具有重要的意义。本研究利用itraq技术对糖尿病和糖尿病痛性神经病变患者的血清进行了分析，发现了23种差异蛋白。

在本实验的结果中，糖尿病痛性神经病变组发生上调的蛋白中有3个为炎症反应蛋白，分别为α1-抗胰蛋白酶、血清淀粉样蛋白A(SAA)、C反应蛋白(CRP)。α1-抗胰蛋白酶主要在肝脏，是一种重要的血清蛋白溶解酶抑制物。Graterol[2]等α1-抗胰蛋白酶能够通过细胞内途径活化核转录因子-κB(NF-κB)，而κB(NF-κB)是一种在人体组织细胞中广泛存在，在过度炎症反应中发挥重要作用。C-反应蛋白和SAA是敏感的炎症指标。

S100 A8是低分子量钙结合蛋白，在抑制细胞增殖、导致细胞凋亡和急性炎症反应中发挥重要的作用。该蛋白能够激活单核巨噬细胞的释放，在炎症过程中改变细微的结构骨架，使白细胞的变形能力增加，汇聚到微血管处，使炎症反应级联扩大而而加重组织的损伤。微血管病变是糖尿病痛性神经病变的病理生理学基础。近年来，炎症因子与糖尿病并发症之间的关系也逐渐被认识[3,4]。一项关于糖尿病周围神经病变的研究表明，随着糖尿病周围神经病变程度的加重，S100A8/A9的浓度逐渐增加，提示S100A8/A9可能参与DR患者的血管炎症反应，其浓度的变化对糖尿病痛性神经病变的严重程度有预测作用[5]。Tabur S等研究发现糖尿病合并周围神经病变患者体内S100A8/A9水平明显高于正常人及糖尿病未合并神经病变组，且S100A8/A9水平与C反应蛋白、糖化血红蛋白呈正相关[6]。

凝血栓蛋白-1(thrombospondin-1，简称TSP-1)，是一种细胞外糖蛋白。TSP-1与TGF-β具有非常高的亲和性，具有重要的抗炎症作[7]。Kong P等研究发现,在糖尿病微血管病变患者血清中TSP-1水平会有明显的升高，并且与hs C-RP呈正相关，与MA-IR、HOMA-β水平呈负相关，前者是炎性反应的非特异性敏感指标，后两者则是糖尿病微血管病变的保护因素[8]。

本研究利用iTRAQ技术构建了糖尿病患者和糖尿病痛性神经病变患者血清的差异表达蛋白图谱，为进一步的了解糖尿病痛性神经病变的发病机制，并进行早期的干预和治疗提供了重要的理论和实验依据。但本实验仅为初步研究，样本量相对较少，所筛选出的一系列差异蛋白尚需扩大样本量进一步验证。