基于网络药理学探讨四妙散治疗痛风性关节炎的潜在机制

容伟明 袁长深 段 戡 梅其杰 郭锦荣 卢智贤

1.广西中医药大学研究生院，广西南宁 530000；2 广西中医药大学第一附属医院骨三科，广西南宁 530023

痛风性关节炎是一种代谢性疾病，体内过多的尿酸可在滑液或软骨中积聚并形成尿酸单钠晶体，引起关节炎的发生[1]，其是导致疼痛和致残的主要疾病之一[2]，影响患者的生活质量。随着人们生活水平的提高，发病率也逐年上升[3]。虽然此病是良性疾病，但仍未得到充分治疗。目前多使用非甾体类抗炎药、秋水仙碱和皮质类固醇激素等对症治疗，疗效一般且副作用较大，由于西药治疗的局限性，迫切需要探索中药治疗痛风性关节炎的可行性[4]。

四妙散是由苍术、黄柏、牛膝、薏苡仁四味中药组成，在治疗急性期的痛风性关节炎中，可获得较好的临床效果[5-6]，但其潜在的作用机制尚未清楚。因此，通过网络药理学方法，分析四妙散治疗痛风性关节炎的关键基因和信号通路，为进一步明确四妙散对痛风性关节炎的作用机制奠定基础。

1 资料与方法

1.1 有效成分及其作用靶标

通过中药系统药理学数据库与分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）以“苍术”“黄柏”“牛膝”“薏苡仁”为检索词分别检索四妙散中四味中药的化学成分，筛选出同时符合“口服生物利用度（oral bioavailability，OB）>30%”和“类药 性（drug likeness，DL）>0.18”的化合物，即为中药的有效成分，并检索出其作用的靶标。

1.2 基因名的注释

通过UniProt 数据库注释出靶标相对应的基因名，再利用Cytoscape 软件建立药物-有效成分-作用靶标网络。

1.3 疾病相关基因

在GeneCards 和OMIM 数据库中以“gouty arthritis”为检索词筛选出与痛风性关节炎相关的基因。

1.4 复方直接作用的靶基因

将筛出的四妙散作用靶标和痛风性关节炎相关基因进行交集，相交的结果即为四妙散治疗痛风性关节炎的直接靶基因。

1.5 GO 和KEGG 富集分析

将靶基因导入Enrichr 数据库进行GO 和KEGG途径富集分析，其中GO 包括生物过程（biological process，BP）、细胞成分（cell component，CC）和分子功能（molecular function，MF）；再利用R 软件绘制富集分析的气泡图。

1.6 关键基因

使用STRING 数据库构建靶基因交互系数为0.4的蛋白质-蛋白质相互作用（proteinprotein interaction，PPI）网络，再通过Cytoscape 软件中“cytohubba”插件进行网络拓扑分析筛选出关键基因。

1.7 药物-基因-通路网络构建

为了更直观地了解四妙散治疗痛风性关节炎的关键基因和重要途径，通过Cytoscape 构建药物-基因-通路网络图。

2 结果

2.1 有效成分

通过TCMSP 得到四妙散中65 个独立的有效成分，其中苍术9 个、黄柏37 个、牛膝20 个、薏苡仁9 个；有靶标的有效成分是40 个。

2.2 有效成分-靶标关系网络

40 个有效成分可作用的靶标共有197 个（图1），通过网络拓扑分析显示，有效成分较为重要的是槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）和汉黄芩素（wogonin），被作用最多的靶标是PTGS2、PTGS1 和NCOA2。

图1 药物-有效成分-作用靶标图

2.3 复方直接作用的靶基因

与痛风性关节炎相关的独立基因215 个，再与四味药作用靶标交集得到27 个靶基因（图2），其中四味药物与疾病相关共有的基因3 个，三味药物与疾病相关的基因10 个，两味药物与疾病相关的基因13 个，一味药物与疾病相关的基因1 个。

图2 药物作用靶标与疾病基因交集

2.4 富集分析

利用Enrichr 数据库分析27 个靶基因，在P ＜0.05条件下，得到622 个GO 条目，其中BP 有551 个、MF有63 个和CC 有8 个，KEGG 途径分析共有109 条信号通路。根据P 值选出BP、MF 前10 个显著通路和KEGG 前30 条较为显著的信号通路。BP 结果显示靶基因显著富集于细胞对细胞因子刺激的反应和细胞因子介导的信号通路；MF 揭示靶基因在细胞因子活性和趋化因子活性中显著富集；CC 显示靶基因在富含ficolin-1 的颗粒内腔和富含ficolin-1 的颗粒中较为丰富（图3A～C，见封三）。KEGG 途径富集分析结果显示，靶基因在IL-17 信号通路、TNF 信号通路显著富集（图3D，见封三）。

图3 GO 与KEGG 富集的气泡图

2.5 关键基因

靶基因的PPI 网络包括27 个节点和171 条关系边数，再根据Degree 得分筛选出前10 位较为重要的基因，包括CXCL8、IL-6、PTGS2、CCL2、IL-1B、PPARG、IL-10、MMP9、MAPK1 和MMP2（图4）；再结合药物作用靶点与疾病相关基因的交集，可发现PTGS2、PPARG、CCL2、IL-6、CXCL8 等是四妙散治疗痛风性关节炎的关键基因。

图4 靶基因蛋白质-蛋白质相互作用网络

2.6 有效成分-基因-通路网络

构建有效成分-基因-通路网络，如图5（见封四）所示，浅蓝色圆圈代表关键基因，深蓝色圆圈代表剩下的靶基因，紫色倒三角代表主要有效成分，绿色倒三角代表另外的有效成分，红色正方形代表重要的信号通路。

图5 有效成分-基因-通路网络

3 讨论

痛风性关节炎属中医的“痹症”“历节”“风痹”等范畴。大部分学者认为湿、热、瘀三者的相互作用主导着痛风性关节炎的发展[7-8]，治疗以清热祛湿、祛瘀止痛为主；而方选四妙散切中其病机[5-6]。

本研究筛选到四妙散中40 个有效成分，其中槲皮素、山柰酚和汉黄芩素较为重要，均属于黄酮类化合物，其中槲皮素能降低炎症因子的水平起到抗炎作用[9]，但其不能降低血尿酸的含量[10]。山柰酚则可通过与嘌呤分解代谢中的关键酶-黄嘌呤氧化酶竞争性结合，减少尿酸的形成[11]。

为明确四妙散在治疗痛风性关节炎过程中主要的生物功能和信号通路，对复方可直接作用的靶基因进行富集分析及筛选发现其主要富集在细胞对细胞因子刺激的反应、细胞因子介导的信号通路等生物学过程中和IL-17、TNF 信号通路中。研究发现，在痛风性关节炎患者血液中多种细胞因子的差异表达[12]，这可能是沉积的尿酸单晶体触发促炎性细胞因子IL-1β的释放，进而引起其他细胞因子的反应导致痛风性关节炎的发生[13]，因此通过降低IL-1β 的表达可明显减轻炎症反应[14]。IL-17 信号通路主要是通过内在的NF-κB 和MAPK通路来调节细胞中炎症基因的表达进而控制炎症[15]。IL-17 作为关键炎症细胞因子，在急性痛风性患者血清中呈高表达[16]，降低其含量可消肿和减少白细胞的浸润，因此阻断IL-17 信号通路是治疗痛风性关节炎的一种新策略[17]。TNF 信号通路是在TNF-α 刺激下引起的途径，其可激活NF-κB 并进一步促使炎症的发生[18]。

最后分析可知PTGS2、PPARG、CCL2、IL-6、CXCL8等是四妙散治疗痛风性关节炎的关键基因。PTGS2（即COX-2）在调节炎症和缓解疼痛中发挥重要作用，是非甾体抗炎药的治疗目标[19]，其在急性痛风性关节炎中呈高表达，阻滞其表达可有效抑制炎症的发生[20]。PPARG 是由PPARγ 编码的基因，其可降低痛风性关节炎滑膜中TNF-α 和IFN-γ 的表达而减轻炎症反应[21]。CCL2、IL-6 和CXCL8（即IL-8）是引起炎症反应重要因子；外周血中CCL2 的甲基化不足是导致痛风的危险因素之一[22]，同时血清中IL-6、IL-8 及其他细胞因子在痛风性关节炎发展中发挥重要作用[23]。

本研究是通过网络药理学的方法，挖掘四妙散治疗痛风性关节炎可能的靶基因及信号通路，为进一步研究四妙散治疗痛风性关节炎提供理论依据，但其可能性仍需更多的实验加以验证。