血塞通注射液对OGD/R损伤小鼠脑微血管内皮细胞VEGF通路表达的影响及机制研究

郭杨燕 孙行云 孟繁兴 王 乐 李楠楠

北京中医药大学东方医院脑病一科，北京 100078

脑梗死是指由于多种原因引起脑细胞缺血缺氧性病变坏死，同时产生相对应的神经功能缺损症的疾病，约占脑血管疾病的70%[1]，是中国居民十大死亡原因之首[2-3]。《中国脑梗死中西医结合诊治指南2017》[4]推荐中西医综合治疗脑梗死。中医治疗脑梗死多以活血通络为主，以三七类活血化瘀药为代表的血塞通在临床应用广泛。有研究显示，血塞通可上调患者脑梗死后血清中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）通路信号的表达[5]，但其作用机制还有待进一步研究。可溶性Fms 样酪氨酸激酶1（soluble FMS-like tyrosine kinase 1，sFlt-1）可与VEGF高亲和力结合，抑制VEGF通路信号的表达，具有抗新血管生成作用[6]。sFlt-1 与VEGF、VEGFR-2 相互制约，共同维持血管正常生理功能。本研究拟建立小鼠脑微血管内皮细胞氧糖剥夺/复氧（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）模型，探究血塞通注射液对OGD/R损伤小鼠脑微血管内皮细胞中VEGF、VEGFR-2 和sFlt-1 蛋白表达的影响，探究其对VEGF通路表达的影响及其可能的作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞 小鼠脑微血管内皮细胞系（bEnd.3）（武汉普诺赛生命科技有限公司）。

1.1.2 实验药物 血塞通注射液（云南白药集团股份有限公司，批号：20170913，规格：2 ml∶100 mg/支）。

1.1.3 主要试剂及器材 β-actin（Proteintech）；羊抗鼠-HRP（Abmart，货号：M21001L）；羊抗兔-HRP（上海华安，货号：HA1001）；蛋白marker（北京全氏金生物技术有限公司，货号：DM111）；VEGFA Mouse（abclonal，货号：A17877）、VEGF Receptor 2（abclonal，货号：A5609）；soluble VEGF Receptor 1（Invitorgen，货号：36-1100）；缺氧培养装置（MIC-101，Billups-Rothenberg）；酶标仪（ELX800，Bio-Teck）；电泳仪（EPS300，Tanon）。

1.2 实验方法

1.2.1 OGD/R 模型的建立 氧糖剥夺阶段:吸弃细胞原培养基，使用磷酸盐缓冲液漂洗1 次，以无糖Kreb’s液代替完全培养基培养，放入模块化缺氧培养装置，向装置内通入混合气体（预混的95%N2+5%CO2），充分置换空气10 min，测氧仪测试氧气含量为0 后，夹闭进、出气口，将装置连同细胞放入培养箱中孵育6 h。复氧阶段：缺氧培养结束后，吸弃无糖Kreb’s 液，使用磷酸盐缓冲液漂洗1 次，再以完全培养基在正常条件下培养不同的时间。

1.2.2 氧糖剥夺6 h 对不同种板浓度细胞活力的影响取生长状态良好的细胞接种至2 个96 孔板上，分为板1 和板2。种板的细胞浓度梯度为5×105、2.5×105、1×105、5×104、2.5×104、1×104个/ml。每列设置6 个复孔，空白部分添加磷酸盐，板1 做氧糖剥夺造模处理6 h，板2 做正常培养6 h。培养结束后用CCK-8 溶液给细胞换液并置于培养箱孵育1 h，取出后用酶标仪分别检测2 个板在450 nm 处的吸光度，计算细胞存活率。细胞存活率=（As-Ab）/（Ac-Ab）×100%，As 为造模处理的实验孔OD 均值，Ab 为只含培养基的空白孔OD 均值，Ac 为正常处理的对照孔OD 均值，As-Ab 为板1 的去空白数据均值，Ac-Ab 为板2 的去空白数据均值。

1.2.3 不同浓度血塞通在不同复氧时间点对造模后细胞活力的影响 根据“1.2.2”结果确定细胞种板浓度。查阅相关文献[4]，选择血塞通终药浓度12.5、25、50、100 mg/L 共4 个安全浓度进行实验干预，复氧时间选择3、6、12 h 共3 个水平。实验分为造模组和实验组，均造模处理6 h。复氧阶段，造模组以完全培养基正常培养；实验组分别以不同浓度的血塞通+完全培养基混合液培养。取生长状态良好的细胞接种至3 个96孔板内行氧糖剥夺造模处理6 h。造模结束后，对3 块板2～6 列依次按完全培养基、12.5、25、50、100 mg/L浓度的血塞通+完全培养基混合液的顺序统一换液，每列设置6 个复孔。复氧阶段：板1 的复氧时间为3 h，板2 的复氧时间为6 h，板3 的复氧时间为12 h。采用CCK-8 法检测细胞存活率，方法同上。

1.2.4 Western blot 检测细胞中VEGF、VEGFR2 和sFlt-1 蛋白表达的水平 根据“1.2.3”结果，选用OGD6h/R6h、血塞通浓度100 mg/L 进行后续实验。取生长状态良好的细胞接种至96 孔板内，分为正常组、造模组和实验组。正常组以完全培养液正常培养12 h；造模组氧糖剥夺培养6 h，复氧阶段以完全培养液培养6 h；实验组氧糖剥夺培养6 h，复氧阶段给终药浓度100 mg/L 的血塞通+完全培养基混合液培养6 h。培养结束后，收集各组细胞沉淀于离心管中，加入150 μl裂解液于冰上裂解30 min，-4℃、60 mm、12 000 r/min，离心15 min。BCA 试剂盒测蛋白浓度，根据结果配制分离胶、浓缩胶。将蛋白样品与5×loading buffer 混合后于100℃处理5 min，每孔上样100 μg 细胞总蛋白。使用SDS-PAGE 预制胶以15 mA 恒流电源进行电泳，湿转法转至PVDF 膜上，室温摇床封闭2 h。加入1∶5000 β-actin 抗体，1∶250 VEGFA Mouse 抗体，1∶500 VEGF Receptor 2，1∶50 soluble VEGF Receptor 1，4℃孵育过夜。洗去多余一抗，加入用封闭液稀释HRP 标记二抗（1∶1000），37℃摇床孵育2 h。超敏ECL 化学发光试剂盒发光显影，Image J 软件进行灰度值测定分析。

1.3 统计学方法

数据采用SPSS 21.0 统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差（）表示，采用重复测量方差分析。计数资料以例数或百分比表示，采用χ2检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 OGD/R 模型对细胞形态的影响

正常培养6 h 后，细胞胞浆丰富，呈“旋涡状”紧密排列，边界清晰。缺氧造模6 h 后，细胞回缩，部分细胞变圆漂浮，细胞间连接断裂、间隙变大。见图1。

图1 正常培养及氧糖剥夺造模6 h 后细胞形态（40×）

2.2 最适细胞种板浓度的确定

氧糖剥夺6 h 后，不同种板浓度的细胞存活率分别如下。①5×105个/ml：70.306%；②2.5×105个/ml：69.070%；③1×105个/ml：63.112%；④5×104个/ml：58.947%；⑤2.5×104个/ml：50.922%；⑥1×104个/ml：42.039%。细胞浓度为2.5×104个/ml 时，细胞存活率接近50%，为便于后续实验观察，选择此浓度继续后续实验。

2.3 最适血塞通浓度和复氧时间的确定

整体分析显示：各组间比较、时间点比较，差异有统计学意义（P ＜0.05），交互作用比较，差异无统计学意义（P ＞0.05），提示不同浓度血塞通在不同复氧时间点对造模后细胞活力的影响不同，血塞通浓度与复氧时间不存在协同作用。进一步两两比较，组内比较：各组不同时间点细胞活力比较，差异有统计学意义（P ＜0.05），提示相同浓度血塞通在不同复氧时间点对造模后细胞活力的影响不同。组间比较：复氧3、6、12 h，不同浓度实验组细胞活力均高于造模组，差异有统计学意义（P ＜0.05），提示相同复氧时间点下不同浓度血塞通对造模后细胞活力的影响不同。其中，OGD6h/R6h、血塞通作用浓度100 mg/L 时，造模组与实验组的细胞活力差值最大，提示在该方案下，血塞通对细胞活力的促进效果最显著，为便于后续实验观察，选择此血塞通浓度和复氧时间进行后续实验。见表1。

表1 不同浓度血塞通在不同复氧时间点对造模后细胞活力的影响（，n=6）

表1 不同浓度血塞通在不同复氧时间点对造模后细胞活力的影响（，n=6）

注：与造模组同期比较，aP ＜0.05；与本组复氧3 h 比较，bP ＜0.05；与本组复氧6 h 比较，cP ＜0.05

2.4 血塞通对OGD6h/R6h 模型细胞中VEGF、VEGFR-2和sFlt-1 蛋白表达的影响

与正常组比较，造模组和实验组的VEGF、VEGFR-2和sFlt-1 蛋白的表达均明显升高，差异有统计学意义（P ＜0.05）；与造模组比较，实验组中VEGF 和VEGFR-2蛋白的表达均明显升高，差异有统计学意义（P ＜0.05），sFlt-1 蛋白的表达明显降低，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图2～3。

图2 VEGF、VEGFR-2 和sFlt-1 蛋白条带

图3 血塞通对OGD6h/R6h 模型细胞中VEGF、VEGFR-2 和sFlt-1 蛋白表达的影响

3 讨论

脑梗死又称为缺血性脑卒中，属中医“中风”范畴。病位在脑，常涉及心、肝、肾、脾，病因以积损正衰为主，病机多为气血逆乱，脑脉痹阻，治当以调节脏腑、补气行血、化痰通瘀为主[7]。目前西医治疗脑梗死主要以抗凝、抗板、降纤、溶栓为主[8]，较为公认的是尽早恢复受损脑组织及缺血半暗带的血供、挽救受累的神经细胞，以恢复正常的神经功能[9]。

VEGF 是血管内皮细胞生长特异的有丝分裂原和血管通透性因子，可特异性作用于血管内皮细胞已糖化的多功能蛋白，诱导新生血管形成[10]，对MCAO细胞的恢复起重要作用[11]。VEGF 主要与其受体VEGFR-2 结合，高度特异性地作用于血管内皮细胞的有丝分裂原，促进脑梗死后缺血区血管生成和修复，减少脑梗死的体积、保护神经[12-14]。同时还可动员一些骨髓源细胞和单核细胞到血管中，参与血管生成、诱导基质金属蛋白酶生成，促使内皮细胞释放生长因子[15]。因此，VEGF 和VEGFR-2 两个蛋白的表达情况，可间接反映血管新生状况。sFlt-1 由Flt-1 基因选择性胞外区剪接形成，因其缺乏跨膜结构域和胞内域而无细胞信号转导功能，主要通过与VEGF 结合，中和血浆中VEGF 含量；同时可与VEGFR-2 结合形成异源二聚体，阻断VEGF 介导的受体酪氨酸磷酸化，抑制VEGF通道的激活，是VEGF 的内源性抑制剂[16-17]。

血塞通为临床治疗脑梗死的常用药物，其主要成分是提取自中药三七中的三七总皂苷（panax notoginseng saponins，PNS）[18]。三七主入肝、胃经，功能为散瘀止血，消肿定痛[19]。现代药理学研究显示，三七具有改善能量代谢障碍、保护血脑屏障、修复神经血管等作用[20]。PNS 可促进脑梗死患者的白质纤维结构重塑，改善细胞毒性及血管源性水肿[21-22]，并可刺激骨髓中干细胞因子的产生，通过降低黏附分子对骨髓间充质干细胞的黏附作用促进骨髓间充质干细胞向血浆的动员，改善梗死区的微环境，具有提高梗死区干细胞的存活率、促进干细胞分化为神经细胞之效[23]。研究显示，联合血塞通治疗脑梗死效果显著，具有良好的协同作用和效果，不良反应较少，临床应用安全有效[24-26]。

本研究以缺氧培养装置和无糖Kreb’s 液制备细胞OGD/R 模型，体外模拟脑细胞缺血再灌注损伤的病理过程[27]。筛选出最适细胞种板浓度、复氧时间和血塞通注射液浓度后，在该条件下探究血塞通注射液对细胞内VEGF、VEGFR-2、sFlt-1 蛋白的表达影响。研究结果显示，血塞通注射液对氧糖剥夺损伤后的细胞具有一定改善细胞损伤的作用。在蛋白分子水平上，与正常组比较，造模组的VEFG、VEGFR-2 蛋白的表达明显升高；与造模组比较，实验组的VEFG、VEGFR-2 蛋白的表达更高。提示缺血缺氧等刺激因素使细胞内VEGF 及其受体含量的表达升高，血塞通注射液使氧糖剥夺损伤的细胞内VEGF 及其受体含量的表达更高。与正常组比较，实验组sFlt-1 蛋白表达升高；与造模组比较，实验组的sFlt-1 蛋白的表达降低。提示血塞通注射液可抑制氧糖剥夺损伤的细胞内sFlt-1 蛋白的表达，起到促进VEGF通路表达的作用。

综上所述，血塞通注射液可上调OGD/R损伤的小鼠脑微血管内皮细胞中VEGF通路信号的表达，且其上调VEGF通路信号表达的机制可能与sFlt-1 蛋白的表达受到抑制有关。目前本研究仅从蛋白水平探讨血塞通注射液与VEGF通路表达的关系，后续实验将继续深入研究mRNA 水平是否也有相同趋势的改变。