溴麝香草酚蓝/玉米醇溶蛋白指示标签对金枪鱼新鲜度的监测

张星晖，李婷婷，励建荣,，于昕睿，梅佳林，徐宇辰，谢 晶，王 轰，王明丽，申照华，郭晓华，劳敏军，周小敏，于建洋

（1.渤海大学食品科学与工程学院，生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心，辽宁 锦州 121013；2.大连民族大学生命科学学院，辽宁 大连 116600；3.上海海洋大学食品学院，上海 201306；4.蓬莱京鲁渔业有限公司，山东 烟台 265600；5.山东美佳集团有限公司，山东 日照 276800；6.浙江兴业集团有限公司，浙江 舟山 316120；7.荣城泰祥食品股份有限公司，农业农村部冷冻调理海洋食品加工重点实验室，山东 威海 264309）

随着食品加工产业的迅速发展，食品质量与安全越来越受到公众重视，为了有效保障食品品质、延长食品货架期，开发新型包装材料具有重要意义[1]。智能包装正在我们的生活中慢慢普及，日益成为商品功能延伸和提升包装商品附加值的最佳方案[2]。功能材料型智能包装是通过具备温敏、湿敏、气敏等功能的材料，制成对环境因素具有“识别”和“判断”的包装[3]。应用于食品的气敏包装是利用食品在贮藏过程中产生的某些特征气体与特定试剂产生特征颜色反应等引起包装内指示剂的颜色变化[4]。这样消费者无需破坏食品包装就可以检测食品品质与感知食品新鲜度，提高与消费者之间的互动性，从而减少由于食品变质而造成的浪费[5]。

目前有很多关于将智能包装应用于食品新鲜度监测的研究。Liu Xiuying等[6]开发出一种基于溴甲酚绿并涂在滤纸上的溶胶-凝胶基质层的比色传感标签来监测鱼的新鲜度；Jiang Guangyang等[7]以羧甲基纤维素/淀粉和紫甘薯花青素为原料制备了一种新型指示剂膜，用以监测鱼的新鲜度；Moradi等[8]以细菌纳米纤维素和黑胡萝卜花青素为基础，研制了一种新型智能pH值传感指示器，用于监测虹鳟鱼和鲤鱼鱼片在4 ℃条件下的保鲜/变质情况；但这类指示标签的灵敏度还有待提高，且只能对鱼的新鲜度起指示作用，功能较为单一。在所有固定指示剂的方法中，静电纺丝是一种简单而经济有效的技术，并且可以同时负载除指示剂以外的功能活性物质[9]。且纺丝纳米纤维具有高比表面积，这使得它能够负载更多的活性物质，提供更高效的催化性能[10]，在理论上可使智能包装的灵敏度更高，反应时间更短，对于提高智能指示包装的性能有一定的价值[11]。

金枪鱼栖息于大西洋和地中海的热带和温带水域[12]。鱼肉富含蛋白质、硒、VB6和Ω-3脂肪酸[13]，常用来制作寿司和刺身[14]，具有很高的商业价值。但高脂肪含量也是导致金枪鱼肉易腐败的重要因素。为了实时监测金枪鱼肉的新鲜度，避免因变质造成的浪费，可对其设计智能包装，通过肉眼分辨其新鲜度。溴麝香草酚蓝（bromothymol blue，BTB）在pH 6.0～7.6的环境中颜色由黄变蓝[15]，因此将BTB作为食品的新鲜度指示智能标签的显色材料，灵敏且安全[16]。

因此，本实验将玉米醇溶蛋白（zein，ZN）与BTB共混进行静电纺丝，制成肉眼可见颜色变化的智能指示标签，应用于金枪鱼的新鲜度监测中，对其进行表征，并通过此指示标签对金枪鱼肉新鲜度的监测效果进行了评价。以金枪鱼鱼片在4 ℃贮藏0～6 d的总挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量和不同BTB添加量的指示标签的色度做比较，选出指示效果最佳的指示标签，验证指示标签在金枪鱼新鲜度监测中的效果。本实验可为BTB/ZN指示标签在金枪鱼新鲜度监测方面的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄鳍金枪鱼（体长约为2 m，质量约为100 kg）购于大连市水产市场。

溴麝香草酚蓝 北京索莱宝科技有限公司；玉米醇溶蛋白 上海麦克林生化科技有限公司；氧化镁、氢氧化钠、硼酸 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；冰乙酸、无水乙醇等均为市售分析纯。

1.2 仪器与设备

ET-2535H型静电纺丝设备 北京永康乐业科技发展有限公司；UV-2550紫外-可见分光光度计 上海尤尼柯仪器有限公司；S-4800型冷场发射扫描电子显微镜（scanning electron microscopy，SEM） 日本日立公司；Scimitar 2000 Near型傅里叶变换红外光谱仪（Fourier transform infrared spectrum，FTIR） 美国安捷伦公司；Ultima IV型X射线粉末衍射仪 日本Rigaku公司；Q2000-3236型差示扫描量热仪（differential scanning calorimetry，DSC） 美国TA仪器公司；Czone系列抑菌圈测定及菌落计数仪 杭州迅数科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 BTB溶液紫外-可见光谱比色分析

在紫外-可见分光光度计上分别测定了pH值为5～12时质量分数为1% BTB溶液的紫外-可见光谱（350～750 nm），其中pH 5～12的缓冲溶液是由0.1 mol/L的硼酸和氢氧化钠配制而成。

1.3.2 BTB/ZN纺丝液的制备

参考文献[17]，将ZN加入到烧杯中，再倒入冰乙酸与无水乙醇体积比为2.5∶7.5的混合溶液，制成质量分数为40%的ZN纺丝溶液，在室温下用磁力搅拌器搅拌1 h，混合均匀。经预实验确定较为适宜的BTB添加量范围，再在搅拌均匀的ZN纺丝溶液中加入不同质量的BTB搅拌1 h，待其完全溶解后得到BTB质量分数分别为0%、3%、4%、5% BTB/ZN纺丝液。

1.3.3 BTB/ZN指示标签的制备

取5 mL上述不同质量分数的BTB/ZN纺丝液，调节正电压为10.55 kV，负电压为－1.95 kV，纺丝距离为12 cm，在温度20 ℃、相对湿度50%的条件下进行纺丝，并将得到的纺丝膜放在25 ℃的真空干燥箱中干燥24 h，得到BTB/ZN纺丝膜，即BTB/ZN指示标签，用于后续实验。

1.3.4 BTB/ZN指示标签的表征

取1.3.3节制备的BTB/ZN指示标签，以不添加BTB的ZN纺丝膜作为对照，用于后续的表征。

1.3.4.1 微观形貌的观察

将测试样品喷金，再使用SEM在3 kV电压下检查样品表面形貌。采用ImageJ图像分析软件统计4 种样品的纤维直径分布率。

1.3.4.2 傅里叶变换红外光谱分析

将测试样品剪碎后与溴化钾按1∶50（m/m）比例研磨制片。以KBr为背景使用FTIR进行测定，在光谱扫描范围为4 000～500 cm－1、分辨率为4 cm－1、步宽为2 cm－1的条件下扫描，每个样品扫描两次。

1.3.4.3 X射线衍射分析

用CuKα辐射，在管压40 kV、电流50 mA、测量角2θ扫描范围5°～70°的条件下对样品进行X射线衍射并分析其结晶度。

1.3.4.4 热力学分析

用DSC法分析1.3.3节中不同质量分数的BTB/ZN指示标签。用分析天平称取5.00 mg的指示膜，在氮气气氛（50 mL/min）下，初始温度为25 ℃，以10 ℃/min的恒定速率升温，测定其热稳定性。

1.3.5 BTB/ZN指示标签在金枪鱼中的应用分析

取黄鳍金枪鱼背部鱼肉通过保温箱运至实验室后立即进行加工处理。金枪鱼鱼肉样品处理如下：将鱼肉分成10.00 g小块，放入透明培养皿密封，在每个培养皿的顶部空间放置了BTB/ZN指示标签（面积为1 cm2），进行新鲜度监测。实验在冷藏温度（4 ℃）下进行，每天记录鱼肉的菌落总数、TVB-N含量、pH值及BTB/ZN指示标签的颜色，每次实验3 个平行。

1.3.5.1 菌落总数的测定

参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[18]。取10.00 g金枪鱼鱼肉和90 mL无菌生理盐水一同倒入无菌蒸煮袋中，拍打1 min后梯度稀释至合适浓度。取稀释好的菌液1 mL于培养皿中，再倾注约25 mL的平板计数琼脂培养基，充分摇晃，待培养基凝结后于28 ℃培养箱倒扣培养。

1.3.5.2 总挥发性盐基氮含量的测定

参照GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》[19]。称取5.00 g搅碎的金枪鱼鱼肉至消化管中，再加入0.50 g氧化镁粉末，混匀，将消化管连接到全自动Kjeldahl分析仪并进行分析。计算TVB-N含量，并以mg/100 g表示。

1.3.5.3 pH值的测定

参照文献[20]，称取5.00 g搅碎的金枪鱼鱼肉，加入45 mL蒸馏水，用均质机进行均质后，静置30 min，过滤，用pH计测定滤液的pH值。

1.3.5.4 图像和数据采集

指示标签图像由Czone系列抑菌圈测定及菌落计数仪采集，再用Photoshop软件进行进一步处理，提取R、G、B值。为了计算与每个不同BTB添加量的指示标签归一化R、G、B值相关的色度参数，参考文献[21]计算色度参数X来表征颜色的变化。

式中：X为表示颜色变化的色度参数；R指红色值；G指绿色值；B指蓝色值。

1.4 数据处理与分析

每组实验设置3 个平行，使用SPSS Statistics 19软件进行Duncan多重比较显著性分析，采用Pearson法进行相关性分析。使用Origin 8.5软件绘图。

2 结果与分析

2.1 BTB溶液的紫外-可见光谱比色结果

从图1A中能够看出BTB溶液在不同pH值下的颜色变化情况：黄色（pH 5～6）、绿色（pH 7～8）、蓝色（pH 9～10）和墨蓝色（pH 11～12）。如图1B所示，在pH 5时，在431 nm和616 nm处各有一个吸收峰，且431 nm处的吸收峰峰高比616 nm处的吸收峰略高；在pH 8时，在426 nm和615 nm处各有一个吸收峰，且这两个吸收峰的峰高几乎相同；在pH 9时，在407 nm和613 nm处各有一个吸收峰，且613 nm处的吸收峰峰高大于407 nm处的吸收峰。这是由于溴百里酚蓝是一种有机弱酸，在低pH值（5～6）下，溶液中的主要成分是溴麝香草酚蓝的黄色酸式（acid bromothymol blue，HBB）。随着pH值的增加，溴百里酚蓝的蓝色碱式BB－的浓度逐渐增加，并引起浅绿色的颜色变化（pH 7～8）。随着pH值继续增加至9～12，产生大量的蓝色BB－[22]。此外，溶液的最大吸收峰随着pH值的增加而转移到更高的波长。BTB在pH值为5～12时的明显颜色变化可使BTB/ZN指示标签具有良好的pH值指示效果。

图1 不同BTB溶液的颜色和紫外-可见光谱Fig. 1 Color and ultraviolet-visible spectra of BTB solution at different pHs

2.2 BTB/ZN指示标签的微观形貌

图2为BTB/ZN指示标签的微观形貌和直径分布图。从图2A中可以看出，ZN具有优良的纺丝性能，静电纺丝ZN纤维呈圆柱形，表面光滑。纤维直径集中分布在275～325 nm之间。而添加BTB后的BTB/ZN指示标签纤维直径明显增大，BTB质量分数为3%的BTB/ZN指示标签纤维直径较均匀地分布在425～450 nm之间；质量分数为4%的BTB/ZN指示标签纤维直径较均匀地分布在550～600 nm之间；质量分数为5%的BTB/ZN指示标签纤维直径较均匀地分布在700～750 nm之间，总体形貌较好。纤维直径随BTB添加量增加而增加，可能是因为随着BTB质量分数的增加，纺丝所需电压增加，在静电纺丝中纳米纤维形态的影响是随着电压的增强，纳米纤维会变得更粗，并且纺丝过程中的不稳定性更加明显[23]。因此BTB/ZN指示标签的纤维直径较ZN膜明显增大。这与覃小红等[24]的研究结果一致。

图2 不同BTB添加量的BTB/ZN指示标签的SEM图和直径分布图Fig. 2 SEM and diameter distribution of BTB/ZN indicator labels with different BTB amounts

2.3 BTB/ZN指示标签的FTIR分析结果

如图3所示，ZN纺丝膜的FTIR光谱在3 312 cm－1处有较宽的吸收峰，这是由于大量的O—H伸缩振动。1 663 cm－1处的吸收峰为C—O伸缩振动，属于酰胺I带；1 534 cm－1处的吸收峰为N—H平面内弯曲振动和C—N振动，属于酰胺II带，这与饶震红等[25]的结果相一致。另外，此两处的峰位在添加不同质量分数的BTB后均没有发生明显的变化。BTB/ZN指示标签中BTB指纹区的峰几乎全部消失，说明ZN与BTB发生了非键合作用。与ZN纺丝膜相比，BTB/ZN指示标签在3 000～3 500 cm－1处的峰宽变窄，说明指示标签中的氢键数量减少。含3%、4%、5% BTB的BTB/ZN指示标签之间的FTIR光谱几乎无差别，可能是BTB的添加量较少，对于红外光谱的影响不大。上述结果表明，BTB与ZN混合以后，并未明显改变ZN的二级结构，与焦岩等[26]的研究结果一致。

图3 BTB粉末、ZN纺丝膜和不同BTB添加量的BTB/ZN指示标签FTIR图Fig. 3 FTIR spectra of BTB, ZN and BTB/ZN indicator labels with different BTB amounts

2.4 BTB/ZN指示标签的XRD分析结果

如图4所示，ZN粉末在2θ＝8.7°出现了一个特征峰，并且在2θ＝20.7°存在一个较强的衍射峰，这与它具有α-螺旋晶体结构的特性相一致。ZN纺丝膜在2θ＝8.7°、20.7°处的衍射峰与ZN粉末相比变得更平缓，这是由于ZN粉末溶于乙酸和乙醇的复合溶液之后再纺丝，阻碍聚合物的结晶度，致使峰值变缓或位移[27]。另外，不同BTB添加量的指示标签都仅在2θ＝20.9°处出现了一个较强的衍射峰，这表明纺丝膜指示标签为非晶态的无定形物，但结构中存在着一定的有序性。若各单组分分子之间未发生或仅有微弱的相互作用，那么XRD图谱仅显示各组分衍射图谱按比例简单叠加。图中可以看出BTB/ZN指示标签的各衍射峰不仅仅是BTB和ZN两者衍射峰的简单叠加，在BTB/ZN指示标签的衍射图中，BTB和ZN的各特征衍射峰均在一定程度上减弱或消失，且由于BTB添加量相对很少，其特征峰消失得更多。这表明在反应体系各组分间存在较强的作用力，从而导致单组分的结晶性发生变化。

图4 ZN粉末、ZN纺丝膜和不同BTB添加量的BTB/ZN指示标签XRD图Fig. 4 XRD spectra of ZN powder, ZN spinning film and BTB/ZN indicator labels with different BTB amounts

2.5 BTB/ZN指示标签的热力学分析结果

由图5可知，ZN粉末仅在127 ℃附近出现1 个负峰，对应于聚合物链的解离。ZN纺丝膜在132 ℃附近出现吸热峰。相比较ZN粉末而言，ZN纺丝膜最大吸热峰发生略微的偏移，且峰宽变大，这可能是由于静电纺丝工艺略微改变了ZN纺丝膜的理化性质，从而提高了熔融温度[28]。对于BTB粉末，在200 ℃以下没有发现BTB粉末的特征峰，这有可能是BTB的熔点过高，在测量范围内无法显示。对于BTB添加量为3%、4%、5%的BTB/ZN指示标签，其吸热峰分别在125、134、140 ℃，可以看出随BTB添加量的增加，BTB/ZN指示标签的熔融温度也逐渐略微升高，这可能是因为BTB与ZN粉末混合后，没有改变BTB的晶体结构。这与FTIR结果相一致，但由于BTB添加量很少，所以对于纺丝膜熔融温度的影响不大。可以得出，BTB/ZN指示标签随BTB添加量增加，热稳定性逐渐增强。

图5 BTB粉末、ZN粉末、ZN纺丝膜和不同BTB添加量的BTB/ZN指示标签的DSC图Fig. 5 DSC diagrams of BTB, ZN powder, ZN spinning film and BTB/ZN indicator labels with different BTB amounts

2.6 BTB/ZN指示标签对金枪鱼片鲜度指示的应用

如图6A、7所示，贮藏初始金枪鱼鱼片的菌落总数为（3.67±0.75）（lg（CFU/g）），指示标签的颜色为橙黄色，随着贮藏时间的延长，菌落总数呈现上升趋势；贮藏3 d时金枪鱼鱼片的菌落总数为（4.89±0.38）（lg（CFU/g）），此时指示标签的颜色为绿色（图7D）；贮藏5 d样品组的菌落总数达到了（7.47±0.45）（lg（CFU/g）），已超过国际食品微生物委员会的规定（应低于106CFU/g），表明此时的鱼片已经腐败变质，此时指示标签的颜色为蓝色（图7F）。TVB-N含量是蛋白质经微生物的分解作用产生氨和胺类等碱性含氮物质的总含量，如图6B所示，金枪鱼鱼片的初始TVB-N含量为（7.63±0.02）mg/100 g，此时的指示标签呈橙黄色；贮藏3 d时金枪鱼鱼片TVB-N含量为（12.59±0.01）mg/100 g，此时指示标签的颜色由橙黄色变为绿色，在贮藏5 d时，金枪鱼鱼片TVB-N含量为（21.18±0.05）mg/100 g，此时的指示标签颜色由墨绿色变为蓝色，鱼肉已完全腐败（TVB-N含量高于20 mg/100 g）。如图6C所示，金枪鱼鱼片在贮藏期间的pH值在前2 d变化不大，在贮藏3 d开始迅速升高，在贮藏5 d升高速度变缓。这是由于在贮藏前期鱼片中存在一定量的乳酸，使得pH值较为稳定，甚至略有下降，而后腐败微生物数量增多，分解蛋白质产生碱性物质，导致pH值升高。

图6 金枪鱼鱼片贮藏期间的鲜度指标变化Fig. 6 Changes in freshness indexes of tuna fillets during storage

图7 指示标签对金枪鱼鱼片的指示效果Fig. 7 Indication effects of indication label on tuna fillets

2.7 BTB/ZN指示标签指示效果

GB/T 18108—2019《鲜海水鱼通则》[29]规定，鲜海水鱼中TVB-N的含量在0～15 mg/100 g为优级品；TVB-N的含量在15～30 mg/100 g为合格品。由图6B可知，在贮藏0～4 d时金枪鱼鱼片处于优级品级别；5～6 d时金枪鱼鱼片处于合格品级别。由表1可知，X2在2～3 d和4～5 d之间变化最大，即在鲜度变化的时间点发生了最明显的颜色变化。当指示剂添加量较少时，颜色指示效果受壁材限制，无法发挥到最佳效果，但在一定范围内，色素含量越小的标签，其颜色变化反而越大[30]。

表1 不同BTB添加量的BTB/ZN指示标签在金枪鱼鱼片贮藏期间的色度参数变化Table1 Changes of chromaticity parameters of BTB/ZN indicator labels with different BTB amounts when used to detect freshness of tuna fillets during storage

指示标签的色度变化与鱼肉pH值、TVB-N含量、菌落总数之间的相关性分析如表2所示，除pH值和X1外，其他指标之间均显著相关（P＜0.05）。另外TVB-N含量与X2之间的Pearson相关系数（—0.839）绝对值最大（≥0.8），即二者极强相关。因此选用BTB添加量为4%的指示标签并以TVB-N含量作为指标进行应用，即当BTB添加量为4%时BTB/ZN指示标签的指示效果更加明显，即为最佳指示标签。

表2 不同BTB添加量的BTB/ZN指示标签色度变化与pH值、TVB-N含量、菌落总数变化相关性与显著性分析Table2 Correlation and significance analysis between color change of BTB/ZN indicator labels with different BTB amounts and changes in pH,TVB-N content and total viable count

3 结 论

本研究采用单轴静电纺丝工艺制备了一种基于BTB指示剂的金枪鱼鱼肉新鲜度指示标签，通过SEM、FTIR、XRD、DSC等对BTB/ZN指示标签的形貌和结构进行表征，并将其应用于金枪鱼4 ℃保鲜实验中。结果表明，BTB/ZN指示标签的微观结构良好；指示标签中各组分之间不发生化学反应；指示标签的热稳定性良好。通过测定指示标签的显色效果，发现其对金枪鱼鱼肉的新鲜度具有明显的指示作用，指示标签随时间的变化，颜色从橙黄色变为墨绿色再变为深蓝色，并且当BTB添加量为4%时，可以灵敏地指示金枪鱼鱼肉的鲜度变化。另外，BTB/ZN指示标签作为一种新型的指示标签，还可以负载挥发性抑菌物质，作为一种多功能新型包装材料应用于食品工业。