基于ITS2序列的钩藤属药用植物的分子鉴定

王江瑞，谈利红，熊可慧，姜理华*，唐倩（. 江苏知原药业股份有限公司，江苏 无锡 494；. 重庆医药高等专科学校，重庆 40；. 国家卫生健康委能力建设和继续教育中心，北京 00044）

中药材钩藤为茜草科钩藤属的多基源植物，《中国药典》2020年版中将钩藤（Uncaria rhynchophylla（Miq.）Miq. ex Havil）、华钩藤（Uncaria sin-ensis（Oliv）. Havil.）、大叶钩藤（Uncaria macrophyllaWall.）、毛钩藤（Uncaria hirsuteHavil.）以及无柄果钩藤（Uncaria sessilifructusRoxb.）收录于钩藤项下，其药用部位均为干燥带钩的茎枝[1]。除此之外，市场上的商品钩藤种类十分混乱，除药典规定的外还掺有攀茎钩藤[Uncariascandens（Smith）Hutchins.]等其他钩藤属植物。对于中药材的鉴定，一般采用性状鉴定、显微鉴定以及理化鉴定等传统手段[2]，由于钩藤属植物其化学性质、外观性状都差异不大，因此很难运用传统手段将其区分。近年来，分子生物学技术不断发展，并在中药材鉴别领域得到了广泛的运用[3-9]，本文采用DNA条形码技术对药典中钩藤属植物及其混伪品进行测序并构建其发育树，并与GenBank中现有钩藤属植物的ITS2序列进行对比归类，从而从分子遗传学上对其进行鉴别，为钩藤属植物的鉴别提供依据。

1 材料

Allegra X-30R Centrifuge离心机（BECKMAN COULTER公司）；凝胶电泳成像系统、iCycleriQ Multi-Color Real-Time PCR仪（BIO-RAD公 司）；全自动进样品快速球磨仪（上海净信实业发展有限公司）；dNTP，2×Taq PCR MasterMix（天根生化科技有限公司）；植物DNA提取试剂盒（ThermoFisher）；通用引物ITS2F/ITS3R由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成。

本研究所用的钩藤来自云南、四川、广州等地，包括6个物种31个样品，具体信息见表1。实验室样品经重庆医科大学中医药学院王刚教授鉴定为茜草科Rubiaceae植物钩藤的干燥带钩茎枝。

表1 药材及其来源Tab 1 Medicinal materials and their source

2 方法与结果

2.1 DNA提取

取钩藤新鲜叶片各约30 mg，加入2 mL液氮，用DNA快速球磨仪研磨5 min（30次·s－1），用植物DNA提取试剂盒提取总DNA，沉淀剂为三氯甲烷[10]，其余步骤均按照试剂盒说明书进行。

2.2 PCR扩增及测序 PCR扩增正向引物ITS2F为5'＞ATGCGATACTTGGTGTGAAT＜3'，反向引物ITS3R为5'＞GACGCTTCTCCAGACTACAAT＜3'。PCR反应体系为25 μL，包括2×Easy Taq PCR Super Mix（Trans Gen Biotech Co.）12.5 μL，2.5 μmol·L－1正反引物各1.0 μL，模板DNA为2 μL，ddH2O为8.5 μL。PCR扩增程序：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，退火温度为56℃，30 s；72℃延伸2 min，30个循环；72℃延伸10 min。反应结束后取5 μL反应产物，利用琼脂糖凝胶电泳检测纯度，观察到条带单一，表明PCR扩增良好（见图1），再将扩增好的DNA送至华大基因科技有限公司进行双向测序。从PCR扩增图可以看出，钩藤属植物的ITS序列长度约在500～750 bp，并且不同种之间序列长度差异较小。

图1 样品PCR扩增结果Fig 1 PCR amplification results of samples

2.3 序列数据处理与提交

利用CodonCode Aligner V 6.0.2对测序峰图进行校对拼接，除去引物区。基于隐马尔夫模型的HMMer注释方法将所有测得的序列用CodonCode Aligner V 6.0.2除去两端的5.8 S和28 S区，从而获得内部转录间隔区ITS2序列。再利用MEGA6.0进行序列的分析比对，并计算K2P遗传距离，建立NJTree。

2.4 聚类分析

通过MEGA 6.0软件，基于各个钩藤的ITS2序列，构建NJTree（见图2，支上数值仅显示自展支持率≥50%），从图中可以看出，钩藤属6个种17个样本各聚为一类，并依次与GenBank中钩藤属的各个种相聚为一类，表现出单系性，与其他同属植物之间可以明显地区分。再者，华钩藤与钩藤亲缘关系较药典收载的其他钩藤更近，这与朱爽等[11]分析的结果一致。因此，ITS2序列作为DNA条形码可准确快速地鉴别钩藤属及其近缘物种。

图2 基于ITS2序列构建的钩藤属NJTree（boot strap score 1000 replicates）Fig 2 NJTree of Uncaria Schreber nom. cons. based on ITS2 squence

2.5 钩藤属ITS2序列特征

本研究比较了钩藤属6个种17个样品，其ITS2序列长度在220～224 bp，大叶钩藤、毛钩藤、华钩藤、无柄果钩藤以及攀茎钩藤相对于钩藤在ITS2序列上各出现11、4、3、13和8个变异位点；与下载于GenBank上的钩藤属标准药材进行比对，并应用MEGA 6.0软件以Kimura 2-parameter（K2P）计算遗传距离，其钩藤属种内遗传距离为0～0.020，构建其NJTree可以明显区分钩藤与攀茎钩藤。

3 结论与讨论

钩藤是我国传统中常用的息风止痉类中药，其茜草科钩藤属植物在全世界约有70多种，我国约有14多种，其物产资源丰富[12]，而《中国药典》中只收载了5种钩藤属植物，市场上销售的钩藤药材较为混乱，仅靠传统手段难以区分，为了正本清源以及有效快速准确鉴定钩藤属植物，本研究运用了DNA条形码技术来对其进行鉴别。结果表明运用ITS2序列能明显区别药典中收载的5种钩藤植物及攀茎钩藤，同时根据构建的系统聚类树也能很清楚地将其区分。DNA条形码技术是近年来国际上发展起的新的生物物种鉴定技术，应用DNA分子标记技术对中药材原植物进行鉴定已成为研究的热点[13-18]，DNA条形码技术因其不受外界因素、生物发育阶段或器官组织的影响，为基因水平的鉴定提供了一定的基础，并且中药材的DNA分子标记技术都是以ITS2序列为主，以psbA-trnH为补充序列来对其进行鉴定。

本研究分别从不同地区收集6种钩藤属样品，并进行基因组DNA提取，ITS2 区序列扩增，序列测定与分析，以及采用MP构建该钩藤样品在其近缘种之间的NJTree树，从图中可以看出样品华钩藤与GenBank数据库中已有的华钩藤（KX675015）聚为一支，支持率达到95%，然后又与钩藤聚为一支；样品大叶钩藤、无柄果钩藤以及毛钩藤单独聚为一支，支持率分别达到96%、99%及87%。由此可见，从分子生物学和遗传学的角度分析，各个钩藤属样品与GenBank数据库中相应钩藤相对应，并聚为同一支，并且可以很好地区分各个钩藤属相近的物种。

因此，采用DNA分子技术——ITS2序列能更加准确、高效、快速地用于植物物种之间的鉴别，为钩藤药材以及其他药用植物的真伪鉴别提供有效的手段，同时为药品监管部门提供可靠手段。