一种小鼠原代肝细胞的分离及培养方法

刘青青

（苏州大学剑桥-苏大基因组资源中心 江苏·苏州 215123）

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

显微镊子、眼用手术剪刀和镊子、26G留置针、70 m滤网、0.45 m过滤器、50mL离心管、10cm细胞培养皿、蠕动泵（LongerPump）、体式解剖镜（Nikon）、显微镜（Olympus）、台式离心机（Thermo）、高压灭菌锅（厦门致微）、细胞培养箱（Thermo）。

1.2 试剂

D-Hank’s平衡盐溶液（PB180321）、DMEM 低糖（PM150246）、DMEM/F12（PM150313）、DMEM 高糖（PM150210）、200mM的Glutamine（PB180419）、1M 的HEPES（PB180325）、PBS、FBS、100×双抗、0.25%Trypsin购自武汉普诺赛生命科技有限公司。DNaseI（KGF008）购自凯基生物。三溴乙醇（T48402）、2-甲基-2-丁醇（240486）、乳酸钠（L4263）、地塞米松（D4902）、CollagenI（C3867）、胶原酶 IV（C5138）、EGTA（E3889）购自 Sigma 公司。无水乙醇购自国药集团化学试剂有限公司。

1.3 溶液配制

（1）麻醉液：称取10g的三溴乙醇，加入10mL的2-甲基-2-丁醇，4℃溶解过夜，使之充分溶解。取出上述溶液1.2mL，加ddH2O定容至100mL，颠倒混匀，4℃避光保存。

（2）100mM EGTA：称取3.804g的EGTA，加入50mL的ddH2O搅拌溶解，搅拌过程中加入2M的NaOH促溶，待 EGTA完全溶解后，调节 pH至7.2后，溶液定容至100mL。高压灭菌后备用。

（3）地塞米松：25mg的地塞米松，加入25mL的无水乙醇，配制成2.55mM（1mg/mL）。取出1mL加入49mL的DMEM高糖培养基，稀释成51 M（20 g/mL）的储存浓度。

（4）Collagen I包被培养板：5mg/mL的Collagen I取出1mL，加入49mL的PBS溶液，将Collagen I稀释为0.1mg/mL。10cm培养皿中加入10mL的0.1mg/mL的Collagen I，室温静置2小时以上或者4℃过夜包被。包被后的培养皿使用前在室温恢复30min，吸弃包被液，用PBS洗涤1次后，可接种细胞。

（5）2%胶原酶IV：称取0.5g的酶，加入25mL的DHank’s平衡盐溶液，搅拌溶解30min，用0.45 m滤器过滤去除不溶颗粒，以免灌流时堵塞血管。

（6）灌流液I：吸取0.5mL1M的HEPES，0.5mL的100mM的EGTA，0.5mL 的100×双抗，用 D-Hank’s补足至 50mL。

（7）灌流液II：吸取0.5mL1M的HEPES，0.5mL的2%胶原酶IV，0.5mL的100×双抗，DMEM低糖补足至50mL。

（8）洗涤液：吸取2.5mL的FBS，10 L的60%w/w乳酸钠，4 L 的 DNase I，0.5mL 的 100×双抗，DMEM/F12补至50mL。

（9）肝细胞培养基：吸取5mL的FBS，0.5mL的100×Glutamine，0.1mL的51 M地塞米松，0.5mL的100×双抗，DMEM高糖补至50mL。

1.4 实验动物

9-12周龄的SPF级C57BL/6J雄鼠购自上海斯莱克实验动物公司，饲养于苏州大学实验动物中心SPF级屏障系统。温度控制在23±2℃，昼夜明暗交替时间12/12h。动物实验操作严格遵守苏州大学实验动物伦理委员会的要求。

2 方法

（1）灌流液I、II在水浴锅内37℃预热10min。

（2）留置针连接到蠕动泵硅胶管，以5mL/min流速先灌流75%酒精，灌流5min。然后灌流D-Hank’s平衡盐溶液5min。最后以2mL/min流速灌流5min灌流液I，直至管内无气泡，全部充盈灌流液I，暂停蠕动泵，备用。

（3）小鼠按照30 L/1g体重的剂量，腹腔注射麻醉液，等待2-3min小鼠进入深度麻醉。

（4）拎起鼠耳，将小鼠躯干浸泡于75%酒精30s，拎出在吸水纸上吸去多余酒精。

（5）固定小鼠四肢，使之呈“大”字形。在小鼠下肢腹部中线位置剪开皮肤和肌肉层，暴露腹腔。用镊子把胃肠部拨到右边，找到门静脉和下腔静脉。

（6）体式解剖镜下边观察边用眼科镊与显微镊配合，轻轻剥离下腔静脉处的白色薄膜和脂肪层，将留置针水平刺入下腔静脉。

（7）开启蠕动泵，灌流液I以2mL/min灌流约10s，肝脏颜色微微变浅、轻微膨胀时立即剪开门静脉血管。

（8）持续灌流2min后，调整流速为3mL/min灌流2min。以后每灌流2min，流速增加1mL/min，直至最大灌流速度5mL/min。持续灌流至肝脏变成沙黄色，无血液留出。灌流液I总灌流时间约8-10min。

（9）灌流液转换成灌流液II继续灌流7-10min。灌流过程中，可以用镊子夹闭门静脉剪破口前端30s然后再松开，让消化液充盈肝脏，使其充分消化。待肝脏微微膨胀，镊子轻轻按压肝脏后，按压痕迹不会回弹时，即为肝脏消化完成。

（10）剪下肝脏放到含有10mL洗涤液的培养皿中，用眼科剪或200uL枪头撕开肝脏外包膜，在溶液中抖动肝脏从而释放肝脏细胞。

（11）上述细胞悬液用70 m细胞滤网过滤。过滤液按照50g/min转速离心2min，使肝细胞沉淀下来。

（12）弃上清，加入15mL洗涤液重悬，50g/min离心2min，吸弃上清。重复洗涤2-3次。

（13）加5mL肝细胞培养基重悬，取细胞悬液加台盼蓝染色，统计细胞数及活率。

（14）按照3×105个/mL有活性的肝细胞密度接种于Collagen I包被的培养皿中，细胞置于37℃，5%CO2培养箱中培养6-8h。

（15）培养6-8h后，吸弃旧培养基，PBS洗涤2次，去除未贴壁的肝细胞。

（16）加入新鲜的肝细胞培养基，细胞置于培养箱中培养，每2天更换培养基。

3 结果

9-12周龄C57BL/6J雄鼠经过肝脏灌流消化，平均每只小鼠可获得3×107个肝细胞，细胞活率达80%。原代肝细胞培养6-8小时，细胞贴壁；培养24小时内，肝细胞呈现有边界的多边形，大部分细胞为两个或多个细胞核（Fig1）。肝细胞培养超过24小时，细胞形态逐渐发生变化，变为不规则形（见图1）。

Fig1 原代肝细胞（200×放大倍数）

4 讨论

肝脏是机体最大的消化器官、解毒器官，也是重要的免疫器官。肝脏中，80%的细胞是肝细胞（肝实质细胞），大约20%细胞为非实质细胞，主要由肝窦内皮细胞、肝星状细胞、巨噬细胞、胆管细胞、淋巴细胞等多种细胞组成。

肝细胞对pH、渗透压以及ROS等极其敏感，直接剪碎肝脏并用消化酶消化很难获得有活性的肝细胞，必须通过肝门静脉或下腔静脉灌流的方式来消化肝组织。而小鼠的肝脏小，门静脉细，导致灌流技术较难掌握，阻碍了小鼠原代肝细胞的体外研究，譬如原代肝细胞能量代谢分析等。

本方法使用DMEM低糖、DMEM/F12作为灌流洗涤液，与部分文献报道使用Williams’培养基E相比，两者提取出的肝细胞数量和活率差异不大，并且使用DMEM系列培养基还具有价格便宜、采购周期短等优点。

在灌流过程中，发现灌流速度对肝细胞的活率有较大影响，推测是灌流速度太快，导致肝脏过度膨胀，肝内压增大，使肝细胞活率下降。因此，灌流时，流速调整宁慢勿快。灌流法常用肝门静脉或下腔静脉作为进针处，经过比较试验发现，下腔静脉比门静脉粗大，血管走向清晰笔直，进针相对容易，下腔静脉进针法较易掌握。