2017-2020年我国部分地区PRRSV流行毒株变异情况分析

吴 瑕，劳梦琴，谭祥梅，陈鹏飞，于家荣，朱钧锐，张玉娇，虞凌雪，高 飞，姜一峰，童光志，周艳君

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是引起母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道症状及死亡的高度接触性传染病，其病原猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）是一种易于发生变异和重组的单股正链RNA病毒，该疾病可造成持续性感染和免疫抑制，对养猪业危害极为严重[1]。上世纪80年代PRRS在美国首次被报道，当时因病原体未知被称为“猪神秘病”[2]，我国于1996年首次分离到PRRSV并命名为CH-1a[3]，2006年此后流行的PRRSV基因组发生变异，在Nsp2基因处出现30个氨基酸不连续缺失，称之为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus，HP-PRRSV），该毒株可感染各个年龄阶段的猪只，发病率可达50%～100%，死亡率达20%～100%，感染猪群主要表现出高热、高发病率和高死亡率的典型特征，给我国养猪业造成极大经济损失[4-5]。2014年，我国报道了基因组出现明显变异和易重组的NADC30样PRRSV[6-8]。近年来，PRRSV重组毒株的增加和重组频率的提高，使得PRRSV在我国的流行情况变得更为复杂，表明PRRSV基因重组在病毒进化中发挥了重要作用[9]，而PRRSV的不断变异和重组也给目前PRRS的控制带来了不利影响，由此可见，及时监测PRRSV的变异情况是疫情有效防控的重要保障。本研究对2017-2020年采集自上海市、浙江省、江苏省等不同发病猪场的血清和组织样品进行PRRSV检测，并对流行毒株的Nsp2和ORF5等基因进行遗传进化和序列比较分析，分析PRRSV在我国部分地区的流行趋势和变异情况，为指导临床上对PRRS疫情的防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 病料样品来源 发病猪临床样品566份，为2017-2020年采集自上海市、浙江省、江苏省、江西省、河北省、湖北省、新疆维吾尔自治区等7个省区内出现流产、咳喘、发热和死亡的养猪场中发病猪的血液和肺脏、淋巴结、脾脏等组织脏器。

1.2 主要试剂 E.Z.N.A Toatal RNA Kit和Gel Extraction kit购自Omega公司；反转录酶、2× LATaqPremix、DL2000 DNA marker、DL5000 DNA marker、琼脂糖、pMD18-T载体购自TaKaRa公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit购自ThermoFisher公司。

1.3 样品处理与RNA提取 取组织样品约0.5 g于2 mL离心管中剪碎，加入1 mL的无菌PBS后用组织高通量研磨仪将其充分碾磨，组织研磨液经4℃，10 000 ×g离心10 min，取上清液保存于-80℃备用。取适量上清液用于RNA提取，所有样品RNA的提取均根据E.Z.N.A Toatal RNA Kit的说明书操作。将获得的RNA按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit的说明进行反转录为cDNA。

1.4 引物设计及RT-PCR扩增 根据CH-1a（GenBank登录号：AY032626）、HuN4（GenBank登录号：EF635006）以及NADC30（GenBank登录号：JN654459）基因组中Nsp2基因序列，设计检测引物（表1），其中用Nsp2引物扩增片段大小可以区分经典类毒株（1021 bp）、HP-PRRSV类毒株（931 bp）和NADC30类毒株（628 bp）。PCR扩增反应体系（20 μL）为：2× LATaqPremix 10 μL，上、下游引物各1 μL（10 pmol/L），cDNA样品1 μL，ddH2O 7 μL。PCR反应条件为：98℃预变性30 s；98℃变性10 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环；72℃终延伸7 min。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分析，同时，选择PCR呈阳性的样品进行DNA胶回收，将目的片段克隆至pMD18-T载体后进行基因测序。

表1 PRRSV检测及基因扩增引物Table 1 Detection and gene amplification primers of PRRSV

1.5 基因序列分析 应用DNAStar软件的Clustal W方法对测序得到的PRRSV基因序列与参考毒株（表2）进行核苷酸和氨基酸序列比对分析。应用MEGA7.0对Nsp2和ORF5基因进行进化树分析。

表2 本研究使用的参考毒株信息Table 2 Reference strain information used in this study

2 结果

2.1 PRRSV的检测结果 以采集样品cDNA为模板进行RT-PCR检测。结果显示：所检样品中PRRSV阳性样品共有246份，部分样品Nsp2基因扩增产物与NADC30样毒株大小一致（图1），但各地猪场阳性率差异较大，最低为3.92%，最高达71.60%（表3）。

图1 PRRSV ORF7和Nsp2基因PCR检测结果Fig.1 Identification of PRRSV ORF7 and Nsp2 gene by PCR

表3 PRRSV样品统计Table 3 The sample statistics of PRRSV

2.2 Nsp2基因进化树分析 从阳性样品中选择31份样品进行Nsp2基因克隆和测序，与GenBank的代表性参考株序列进行比较分析，并绘制系统进化树，结果显示，Nsp2基因进化树将国内的美洲型PRRSV基因分成4个谱系：NADC30-like（谱系1）、QYYZ-like（谱系3）、VR-2332-like（谱系5）和HuN4-like/CH-1a-like（谱系8）；本研究获得的31株PRRSV Nsp2基因主要分布在3个谱系中，即Lineage 8（属于HP-PRRSV类毒株）、Lineage 5（属于VR2332类毒株）、Lineage 1（属于NADC30类毒株），由此表明本研究采集样品的发病猪场中主要是以HP-PRRSV类毒株流行为主，NADC30类毒株感染并存（图2）。31株Nsp2基因测序结果显示，各毒株基因长度为1924～2232 bp。与美洲型的代表性参考株VR2332、CH-1a、BJ-4、HuN4、JXA1和NADC30等进行同源性分析。结果显示：31株Nsp2基因之间的核苷酸同源性为57.2%～100%，氨基酸同源性为49.6%～100.0%；与VR2332、CH-1a、BJ-4经典株的核苷酸同源性为57.9%～97.9%，氨基酸同源性为49.1%～96.4%；与HuN4、JXA1等HPPRRSV株的核苷酸同源性为58.8%～99.7%，氨基酸同源性为51.4%～99.2%；与NADC30株的核苷酸同源性为58.8%～92.4%，氨基酸同源性为53.2%～88.1%。以上结果表明，PRRSV在自然流行过程中发生了不同程度的变异。

图2 PRRSV阳性样品Nsp2基因的进化树分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis of Nsp2 gene in PRRSV positive samples

2.3 Nsp2氨基酸序列分析 在PRRSV编码的各种蛋白中，Nsp2基因变异最大，常被作为病毒进化和流行病学分析的靶基因，本研究获得的31个分离株的Nsp2基因编码氨基酸长度为635～771 aa。其中位于谱系8的23个分离株在481 aa和533～561 aa位置具有不连续缺失30个氨基酸（1+29 aa），与HP-PRRSV类毒株一致。值得注意的是，其中ZJ11/2017在769～782 aa位置又缺失了14个氨基酸（1+29+14 aa）。位于谱系5的2个分离株与VR2332类似，没有氨基酸发生缺失和插入。位于谱系1的6个分离株在320～431 aa、481 aa和533～552 aa位置均有不连续缺失131氨基酸（111+1+19 aa），保持与NADC30类毒株一致的特征，但其中HBap4/2018与VR2332相比在464～468位又缺失了5个氨基酸（111+5+1+19 aa）（图3）。

图3 PRRSV Nsp2氨基酸序列比对Fig.3 PRRSV Nsp2 amino acid sequence alignment

2.4 ORF5遗传进化及同源性分析 为了分析PRRSV ORF5基因与其他参考毒株的亲缘关系，应用MEGA7.0软件绘制了ORF5基因系统发育进化树（图4）。结果显示：本研究获得的21株ORF5基因序列被分布于3个谱系，其中15株属于谱系8（HPPRRSV类毒株），5株属于谱系1（NADC30类毒株），1株属于谱系3（QYYZ类毒株）。对获得的21株ORF5基因与参考株进行核苷酸和氨基酸同源性分析。结果显示：21株ORF5基因之间的核苷酸同源性为82.6%～99.5%；与VR2332、CH-1a经典株的核苷酸同源性为84.4%～100%，氨基酸同源性为83.1%～100%；与JXA1、HuN4等HP-PRRSV株的核苷酸同源性为84.6%～99.5%，氨基酸同源性为83.7 %～99.5%；与NADC30、FJM4等NADC30类的核苷酸同源性为83.7%～94.0%，氨基酸同源性为84.1%～95.0%。

图4 PRRSV阳性样品ORF5基因的进化树分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis of ORF5 gene in PRRSV positive samples

2.5 GP5氨基酸序列比对 对21株ORF5基因进行测序，结果显示：ORF5基因为603 bp，编码200个氨基酸，没有氨基酸的插入和缺失。氨基酸比对结果显示：突变主要位于信号肽和两个高变区，在40～57 aa、67～90 aa、107～120 aa和138～160 aa的区域相对保守。在信号肽区的F23/S23突变和B细胞表位中的Q196/R196突变主要存在于Lineage8分离株；而在Lineage1分离株中，其信号肽区（1～31 aa）有8个氨基酸突变，2个高变区（HVR）中有4个氨基酸突变，3个跨膜区中有7个氨基酸突变，与跨膜区重叠的T细胞表位有3个氨基酸突变，另外2个抗原表位中有5个氨基酸突变，其他区域有5个氨基酸突变，提示Lineage1分离株突变程度高。位于GP5HVR1的第32、33、34、35位N-糖基化位点也存在不同程度的突变，N-糖基化位点对病毒感染、抗原特性以及病毒对体外中和抗体的敏感性都很重要。有研究报道R13和R151与毒力有关，本研究获得的Lineage1分离株都存在R13/Q13和R151/K151的突变（除SHtl2/2019的R151没有突变而外），在Lineage8中有4株存在R151/K151的突变（图5）。

图5 GP5蛋白氨基酸序列分析Fig.5 Amino acid sequence analysis of GP5 protein

2.6 Nsp9氨基酸序列比对分析 Nsp9蛋白具有RNA依赖性聚合酶活性（RdRp），参与PRRSV的亚基因组mRNA转录和基因组复制，为了分析PRRSV Nsp9的变异情况，将12株Nsp9基因进行序列比对分析。结果显示：12株Nsp9基因与参考株的核苷酸同源性为85.2%～99.6%，氨基酸同源性为94.2%～99.7%。先前的研究表明Nsp9的519、544、550位是与HP-PRRSV毒力变化相关的氨基酸，本研究获得了12株Nsp9，除了1株的544位氨基酸与经典株一致而外，其余毒株均保持了与HP-PRRSV类毒株一致的氨基酸特征（图6）。

图6 Nsp9与毒力相关的氨基酸比较Fig.6 Comparison of amino acids related to virulence of Nsp9

3 讨论

由于PRRSV基因组易于变异，可导致PRRSV发生免疫逃逸，因此PRRS成为影响全球养猪业的重要传染病之一[10]。尽管在当前为了防控非洲猪瘟疫情而采取了严格的生物安全措施的情况下，一些养猪场依然存在PRRSV感染，对生猪生产造成不利的影响。目前在我国先后流行的有经典的CH-1a类毒株、HP-PRRSV类毒株以及NADC30类毒株等具有不同致病力的毒株[11-12]，因此有必要及时监测PRRSV的基因组变异情况。本研究检测并分析了2017-2020年从上海市、浙江省、江苏省等7个省市的部分发病猪场采集的临床样品，发现样品中PRRSV阳性率仍然较高。Nsp2是PRRSV中变异最大的非结构蛋白，对病毒复制、转录、病毒毒力以及调节宿主免疫应答具有重要作用。Nsp2基因中存在缺失、重组、插入等多种突变方式，使得Nsp2基因片段的大小存在很大差异[13]。因此，Nsp2常作为分析PRRSV遗传变异与进化分析的目的基因，本研究对31株Nsp2基因编码的氨基酸序列进行比对分析，证明PRRSV阳性样品中除了具有HP-PRRSV类毒株和NADC30类毒株的常见氨基酸缺失模式外，还出现了“111+5+1+19 aa”、“1+29+14 aa”的缺失模式，这种缺失模式是否对其致病性产生影响尚不清楚。其中23株流行株保留了HP-PRRSV类毒株的缺失特征，6株具有NADC30类毒株的缺失特征，只有2株与VR2332类毒株一样，没有氨基酸缺失或插入。PRRSV流行株的遗传变异分析结果表明，本研究获得的PRRSV主要分布在谱系L8、L1、L5，其中大部分为L8，其次是L1，表明在2017-2020年采集样品的猪场中流行的PRRSV主要是以HP-PRRSV类毒株为主，其次是NADC30类毒株。

PRRSV ORF5基因也是常用于分析病毒遗传变异的靶基因，其编码的GP5蛋白是结构蛋白中变异最大的蛋白，GP5蛋白存在多个N-糖基化位点和中和性抗原表位，在病毒的复制、毒力以及诱导宿主的中和抗体产生中发挥重要作用[14-15]。在本研究我们对获得的21株ORF5基因进行序列分析，发现有14株与HP-PRRSV类毒株同属一个亚群（L8），5株与NADC30类毒株同属于一个亚群（L1），1株与CH-1a类毒株同属于一个亚群，1株与QYYZ毒株同属于一个于亚群（L3）。表明除了HP-PRRSV流行毒株外，NADC30类毒株的流行逐渐增多。此外，本研究发现有14株在中和表位37～44 aa处发生L39/I39的氨基酸突变，有1株存在H38/L39/Y38S39的氨基酸突变，而中和表位的突变可能有助于病毒逃避疫苗免疫诱导的中和作用，进而降低疫苗免疫保护效率。有研究报道GP5中的R13和R151氨基酸与毒力有关[16]，Nsp9的519、544、550位氨基酸残基是HP-PRRSV毒力的关键氨基酸[17]，本研究获得的毒株中，有5株病毒在GP5蛋白存在R13/Q13的突变，8株存在R151/K151的氨基酸突变；而12株Nsp9中，除了1株在544位氨基酸与经典毒株相同而外，而其他毒株毒力相关氨基酸均与HP-PRRSV类毒株一致，这些关键氨基酸的变异可能会影响PRRSV致病性。此外，发现同一毒株的ORF5和Nsp2基因分别属于不同谱系，表明其可能存在潜在的重组事件。由此可见，突变和重组是PRRSV进化的重要策略，只有实时监测和掌握PRRSV的变异情况及流行动态，才能有效预防PRRSV疫情的发生。