云岭牛毕氏肠微孢子虫和芽囊原虫分子流行病学调查研究

梁霞霞，邹 扬，李涛善，陈 红，曹富琼,，杨建发，邹丰才，孙晓林，朱兴全,,4

（1.甘肃农业大学动物医学院，兰州 730070；2.中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室，兰州 730046；3.云南农业大学动物医学院 云南省高校兽医公共卫生重点实验室，昆明 650201；4.山西农业大学动物医学学院，太谷 030801）

毕氏肠微孢子虫（Enterocytozoonbieneusi）和芽囊原虫（Blastocystissp.）可引起人和动物的微孢子虫病和芽囊原虫病，寄生于人类和多种动物包括家畜的胃肠道，引起宿主发生腹泻、腹痛、呕吐等一系列临床症状[1-2]。研究表明，儿童、免疫力低下的人（如艾滋病病人）以及老年人更易感，且症状相对更为严重[1,3]。目前毕氏肠微孢子虫在我国牛的感染分布较广，其感染率为2.0%～46.8%[4]，而关于牛感染芽囊原虫的报道较少，只在广东省、黑龙江省、青海省和陕西省报道过，感染率分别为1.88%、10.3%、27.07%、24.8%[5-8]。

基于核糖体内转录间隔区（internal transcribed spacer, ITS）序列，目前已报道的毕氏肠微孢子虫基因型至少有470个，分属于11个不同的组（Group 1～Group 11）[1]。其中，Group 1和Group 2包含了许多人和动物都可感染的基因型，因此被认为是人兽共患组，而Group3～Group11通常在特定宿主中被发现，因此被认为是宿主特异组[1,9]。研究发现，至少有40种毕氏肠微孢子虫基因型可以感染牛[4]。基于核糖体小亚基（SSU rRNA）基因序列，目前已在人类、其他哺乳动物、鸟类、爬行动物和昆虫中发现了17种芽囊原虫基因亚型，其中可感染人的亚型有10种，分别为ST1～ST9及ST12[2]。研究表明，牛可感染的芽囊原虫基因亚型有7种，分别为ST1、ST3、ST4、ST5、ST6、ST10、ST14[8]。

云岭牛（Yunling cattle）是由我国科学家自主培育的首个三元杂交肉牛品种。育种过程中，以云南黄牛为母本，婆罗门牛和莫累灰牛为父本，形成含二分之一婆罗门牛、四分之一莫累灰牛和四分之一云南黄牛血缘的新品种[10]。云岭牛综合了云南黄牛适应性强，耐粗饲和莫累灰牛生长快、繁殖性能高、肉质好以及婆罗门牛耐热抗蜱的优良特征，日渐受到广大养殖户和消费者的喜爱[11]。云岭牛可以感染微小扇头蜱，但未见其他寄生虫感染的报道[12]。本研究旨在调查和研究云岭牛毕氏肠微孢子虫和芽囊原虫的感染情况以及基因分布，为防控云岭牛感染这两种肠道原虫病提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 粪便样品的采集 本研究共随机采集云南省云岭牛新鲜粪便样本391份，其中昆明市201份，楚雄市190份。所有的粪便是在牛排泄后立即收集，并分别保存于含2.5%重铬酸钾溶液的15 mL无菌离心管中，记录采样时间、动物的年龄、性别和样品来源等相关信息。最后将采集的样品迅速送至实验室并保存于4℃冰箱用于提取DNA。

1.2 主要试剂 粪便DNA提取试剂盒（离心柱型）购自美国OMEGA公司；ExTaqDNA 聚合酶（5 U/μL）、10×PCR Buffer (Mg2+free)、dNTP Mixture（2.5 mmol/L each）、MgCl2（25 mmol/L）、6×Loading Buffer、DL1000 DNA marker均购自Takara公司；溴化乙锭（EB）购自美国Sigma公司；50×TAE缓冲液购自北京索莱宝公司。本实验所用引物均由西安擎科泽西生物科技有限责任公司合成。

1.3 基因组DNA提取 每个粪便样品在DNA提取之前，先取300 mg左右的粪便至2 mL灭菌离心管中，加入约1 mL灭菌ddH2O充分振荡，11 000 ×g离心5 min，弃去上清液，反复洗涤以除去重铬酸钾溶液。剩余的沉淀（约200 mg）参照粪便基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA，并将提取的DNA置于-20℃保存。

1.4 毕氏肠微孢子虫ITS序列扩增及凝胶电泳鉴定 基于ITS序列，使用参考文献[13]中的扩增ITS序列的引物，对所提取的DNA样品进行巢氏PCR扩增，引物序列见表1，巢式PCR反应条件（25 μL）均为：DNA模板1 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，MgCl2（25 mmol/L）2 μL，10×ExTaqDNA聚合酶1 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O补至25 μL。两轮PCR反应的退火温度均为55℃，第一轮反应的模板DNA为所提取的粪便基因组DNA，第二轮反应的模板DNA则为第一轮PCR反应产物。然后，取5 μL第二轮PCR反应产物混合1 μL 6×上样缓冲液于含溴化乙锭的2.0%琼脂糖凝胶中电泳20 min，阳性PCR样品送西安擎科泽西生物科技有限责任公司进行测序。

表1 扩增毕氏肠微孢子虫ITS 序列的 PCR 引物Table 1 Primers for the nested PCR amplification of ITS sequences of E.benisuis

1.5 芽囊原虫SSU rRNA基因扩增及凝胶电泳鉴定 基于芽囊原虫SSU rRNA 基因，作用参考文献[14]中的扩增引物，采用PCR结合测序的方法检测和鉴定云岭牛芽囊原虫的感染率和基因型，引物序列见表2。PCR 反应体系为：dNTP（2.5 mmol/L each）14.25 μL，10×PCR buffer（Mg2+free）2.5 μL，MgCl2（25 mmol/L）2 μL，F1（50 pmol/μL）1 μL，R1（50 pmol/μL）1 μL，ExTaqDNA聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，模板DNA 2 μL。PCR反应条件参照参考文献[14]中的反应条件并加以改进，将退火温度调整为65℃，PCR反应的模板DNA为所提取的粪便基因组DNA。然后，取5 μL PCR反应产物混合1 μL的6×上样缓冲液于含溴化乙锭的1.0%琼脂糖凝胶中电泳20 min，阳性PCR样品送测序。

表2 扩增芽囊原虫SSU rRNA的PCR引物Table 2 Primers for the amplification of SSU rRNA of Blastocystis sp.

1.6 测序及序列分析 将凝胶成像显示为阳性的第二轮PCR反应产物送测序，获得的原始序列首先通过BLASTn与NCBI的GenBank数据库中获得的序列进行比对，然后参照序列图谱进行校正。再用软件ClustalX 1.83进行校对，确定毕氏肠微孢子虫和芽囊原虫的基因型。

1.7 数据统计分析 使用SPSS 24.0软件中的χ²检验，对云岭牛不同采样地点、不同年龄和不同性别的毕氏肠微孢子虫和芽囊原虫感染率进行统计学分析，当P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 云岭牛毕氏肠微孢子虫感染情况 基于ITS序列，对采集的391份云岭牛粪便样品进行巢氏PCR扩增，有17份扩增出约392 bp的目的片段（图1、表3），总感染率为4.35%（17/391）。其中昆明市和楚雄市的感染率分别为4.48%（9/201）和4.21%（8/190），不同采样地区云岭牛的毕氏肠微孢子虫感染率在统计学上差异不显著（P＞0.05）；在不同年龄的云岭牛中，成年牛感染率为2.06%（6/291），而犊牛的感染率为11.00%（11/100），其感染率的差异极显著（P＜0.01）；雌性牛的感染率为3.50%（11/314），雄性牛的感染率为7.79%（6/77），不同性别的云岭牛的毕氏肠微孢子虫差异不显著（P＞0.05）（表3）。

图1 毕氏肠微孢子虫ITS巢氏PCR扩增结果Fig.1 Nested PCR amplification results of ITS gene of E.bieneusi

表3 云岭牛毕氏肠微孢子虫感染情况Table 3 The prevalence of E.bieneusi in Yunling cattle

2.2 云岭牛毕氏肠微孢子虫基因型鉴定 对本研究中所获得的17份毕氏肠微孢子虫阳性样品，通过ITS序列中243 bp的序列片段比对分析，鉴定出两种已知基因型，BEB8（n=1）和J（n=16），其中基因型J为云南省云岭牛感染毕氏肠微孢子虫优势基因型（表4）。

表4 云岭牛毕氏肠微孢子虫基因型分布Table 4 Genotype distribution of E.benisuis in Yunling cattle

2.3 云岭牛芽囊原虫感染情况 基于SSU rRNA基因序列进行云岭 牛 芽囊原虫的检测，391份云岭牛粪便中共检测到108份芽囊原虫阳性样品，总感染率为27.62%（108/391）（图2、表5）。其中，楚雄市云岭牛芽囊原虫的感染率（30.53%）略高于昆明市（24.88%），但差异不显著（P＞0.05）；在不同年龄组中，犊牛的感染率（47.00%）明显高于成年牛（20.96%），差异极显著（P＜0.01）；在不同性别的云岭牛中，雌性牛的感染率为25.16%，低于雄性牛的37.66%，差异显著（P＜0.05）。

图2 芽囊原虫SSU rRNA 基因PCR扩增结果Fig.2 PCR amplification results of SSU rRNA gene of Blastocystis sp.

表5 云岭牛芽 囊原虫感染情况Table 5 The prevalence of Blastocystis sp.in Yunling cattle

2.4 云岭牛芽囊原虫基因亚型鉴定 通过序列比对分析，在对本研究中测序成功的108个芽囊原虫序列与NCBI的GenBank数据库中的相应序列进行比对，共鉴定出4种芽囊原虫基因亚型，分别为：ST1（n=4）、ST5（n=15）、ST10（n=84）、ST14（n=5）（表6），其中两种为人兽共患基因亚型（ST1和ST5），两种为宿主特异基因亚型（ST10和ST14）。

表6 云岭牛芽囊原虫基因亚型分布情况Table 6 Subtype distribution of Blastocystis sp.in Yunling cattle

3 讨论

毕氏肠微孢子虫和芽囊原虫是两种常见的可引起人畜共患肠道原虫疾病的病原，在全球已有许多关于牛感染这两种肠道原虫的研究报道，但目前还没有任何关于云岭牛感染毕氏肠微孢子虫和芽囊原虫的数据。有鉴于此，本研究首次调查研究了云岭牛毕氏肠微孢子虫和芽囊原虫的感染情况，其研究结果填补了云岭牛感染毕氏肠微孢子虫和芽囊原虫的空白，对云岭牛肠道原虫病的防控具有一定的指导意义。

3.1 云岭牛毕氏肠微孢子虫的感染情况 本研究发现云岭牛毕氏肠微孢子虫的总感染率为4.35%（17/391）（表3），高于甘肃省白牦牛（1.13%）[15]、湖南省水牛（2.2%）[4]以及西藏黄牛的感染率（2.5%）[16]，但低于龙江和牛（7.09%）[17]、西藏牦牛（5.0%）[18]、秦川牛（19.65%）[19]以及河北省和天津市的奶牛的感染率（19.4%）[20]，这些差异提示不同品种的牛对毕氏肠微孢子虫的易感性存在差异。研究还发现，在不同地区牛毕氏肠微孢子虫的感染率也存在差异，与其他省份和其他国家的牛毕氏肠微孢子虫的感染率相比，云岭牛毕氏肠微孢子虫的感染率高于甘肃省（1.13%）[15]和山东省的牛毕氏肠微孢子虫的感染率（2.0%）[4]，低于河南省（21.2%）[4]、上海市（26.5%）[4]、黑龙江省（30.1%）[4]、巴西（17.5%）[21]、阿根廷（14.3%）[22]、韩国（15%）[23]牛毕氏肠微孢子虫感染率。造成这种差异的原因可能与采样时间、检测方法、地理位置、样本量大小等有关。此外，本研究中犊牛毕氏肠微孢子虫的感染率显著（P＜0.01）高于成年牛（表3）。Hu等[21-22]也发现犊牛毕氏肠微孢子虫的感染率比成年牛的更高，与我们的研究结果一致。这可能是因为犊牛的免疫力低下所导致的。

3.2 云岭牛毕氏肠微孢子虫基因型分布 为了揭示云岭牛毕氏肠微孢子虫的基因型分布，本研究对测序成功的17份毕氏肠微孢子虫阳性序列进行序列分析，发现存在两种已知的基因型，其中1个样品为基因型BEB8，16个样品为J，其中J为优势基因型，占阳性总数的94.12%（16/17）（表4），与Xue等[17]报道的中国东北地区龙江和牛和Del等[22]报道的阿根廷奶牛的优势基因型一致，但与甘肃省白牦牛和西藏牦牛的优势基因型BEB4不同[15,18]；提示品种和地域的差异可能会造成基因型分布的差异。而基因型J作为云岭牛感染的优势基因型，广泛分布在雌性（10个）和犊牛（10个）中（表4），这提示J基因型可能是雌性犊牛的易感基因型。此外，在云南省云岭牛中只检测到一个毕氏肠微孢子虫BEB8基因型，且分布在昆明地区，说明该基因型对所调查地区的云岭牛不易感。

3.3 云岭牛芽囊原虫的感染情况 本研究中，云岭牛芽囊原虫的感染率为27.62%（表5），与王莎莎[8]报道的秦川犊牛（27.2%）和Ren等[7]报道的青海省牦牛（27.07%）芽囊原虫感染率接近，但高于王璐阳等[5]在广东省报道的奶牛（1.88%）和Zhu等[6]等在黑龙江省报道的奶牛的感染率（10.3%），这些感染率的差异可能与牛的不同品种有关。本研究还发现，云南省云岭牛芽囊原虫的感染率高于广东省（1.88%）[5]、黑龙江省（10.3%）[6]、土耳其（11.25%）[24]，韩国（6.7%）[25]和伊朗（9.6%）[26]牛芽囊原虫感染率，但却低于泰国（37.2%）[27]、日本（54.1%）[28]、哥伦比亚（80.0%）[29]等地的牛芽囊原虫感染率。这些牛芽囊原虫感染率的差异可能与不同地区有关，但也可能受季节、检测方法和饲养方式等其他因素的影响。此外，本研究发现，芽囊原虫的感染率与年龄密切相关，犊牛的感染率（47.00%）显著（P＜0.01）高于成年牛感染率（20.96%），这与王璐阳等[5-6]报道的结果相一致。我们推测犊牛可能是芽囊原虫的易感群体，但这一结果仍需要进一步验证。另外，本研究还发现不同性别的云岭牛芽囊原虫感染率存在显著差异（P＜0.05），雄性牛的感染率（37.66%）显著高于雌性牛（25.16%）（表5），但之前关于牛感染芽囊原虫的研究未见有此类结果的报道，导致这种差异的原因尚不明确，还需进一步研究。

3.4 云岭牛 芽囊原虫基因亚型分布 本研究通过序列比对在云岭牛中共鉴定出4种芽囊原虫基因亚型（ST1、ST5、ST10、ST14），其中ST10（77.78%，84/108）为优势基因亚型（表6），这与广东省、黑龙江省和陕西省报道的牛感染芽囊原虫的优势基因亚型一致[5-6,8]。此外，本研究中发现的ST1和ST5基因亚型属于人兽共患基因亚型，这两种基因亚型也分别在云南地区的人和羊中报道[30-31]，这些发现也提示云岭牛可能是人或其他动物感染芽囊原虫的潜在传染源，提醒当地养殖人员应当注意防范。云岭牛感染芽囊原虫的优势基因亚型ST10广泛分布于雌性云岭牛（79.75%，63/79），而在雄性牛该基因亚型分布较少（72.41%，21/29）；成年云岭牛ST10的感染率（80.32%，49/61）也高于犊牛（74.47%，35/47）（表6），因此我们推测ST10基因亚型可能对成年雌性云岭牛更易感，但这一结论仍需后续的验证。

综上所述，本研究首次对云南省云岭牛的毕氏肠微孢子虫和芽囊原虫的感染情况进行了分子生物学调查，研究发现云南省云岭牛毕氏肠微孢子虫的感染率为4.35%，芽囊原虫的感染率为27.62%；共鉴定出2种已知的毕氏肠微孢子基因型（BEB8和J）以及共鉴定出4种不同的芽囊原虫基因亚型，分别为ST1、ST5、ST10、ST14，均为已在牛上报道过的基因亚型。本研究结果不仅扩展了毕氏肠微孢子虫和芽囊原虫的宿主范围，而且也为防控云岭牛的这两种肠道原虫病提供了有用的基础数据。