滇重楼皂苷对前列腺癌细胞周期与凋亡的影响

申正超，申吉泓，谢星星，宋 娜，李旭华，石西南，柯坤彬

(1.昆明医科大学第一附属医院 泌尿外一科，云南昆明 650032；2.云南中医药大学，云南昆明 650500)

前列腺癌在欧美国家是男性最多见的恶性肿瘤之一，并且在男性癌症致死病因中排名第1位[1]。在中国，随着老龄人口增加以及检查手段的普及，前列腺癌发病率逐年上升[2]。早期前列腺癌患者的主要治疗方式是手术、化疗等，但大部分前列腺癌患者在初诊时已出现远端转移，目前晚期转移性前列腺癌的标准方案仍为抗雄激素内分泌治疗[3]。然而几乎全部患者在接受雄激素去势治疗1～2年后将进展为去势抵抗性前列腺癌，此类患者一般预后较差，并且现有治疗方法有限[4]。因此急需新型药物来控制前列腺癌，改善患者预后。

滇重楼(Paris polyphylla)运用于中医已有上千年历史，临床上用于痈肿、咽喉肿痛、乳腺炎以及恶性肿瘤等治疗[5]。从滇重楼根茎中提取的滇重楼皂苷(Polyphyllin Ⅰ，PPⅠ)是1种具有生物活性的甾体皂苷。最近许多学者发现，滇重楼皂苷在肺癌、乳腺癌、胃癌等恶性肿瘤中具有广泛的抗肿瘤作用[6-9]。有研究发现滇重楼皂苷在肺癌中具有增高p21蛋白的作用[10]，但滇重楼皂苷在前列腺癌中的研究还相对较少。本文旨在评估滇重楼皂苷影响去势抵抗性前列腺癌细胞株PC-3和DU145的增殖、周期以及凋亡的作用，并进一步观察p21以及磷酸化CDK2蛋白表达的变化，为后期的临床试验提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株、药物与试剂去势抵抗性前列腺癌细胞株PC-3和Du145于中科院上海细胞库购买。滇重楼皂苷购买自瀚香生物科技有限公司(Shanghai,China)，纯度大于98%，以10 mmol/L的浓度溶于二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)中，避光储存于-20 ℃中。F-12、DMEM培养基，胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素-链霉素混合液购自HyClone(USA)；MTT粉末购自美伦生物(China)；Annexin V-FITC凋亡试剂盒购自BD Pharmingen(USA)；pho-RB(Ser795)、GAPDH、Caspase-3、p21waf/cip1、pho-CDK2(Thr160)购自CELL Signaling Technology (USA)；RNA酶、BCA蛋白检测试剂盒购自Thermo(USA)；ECL超敏显色试剂购自苏州宇恒生物科技有限公司(China)。

1.2 细胞培养PC-3与Du145分别采用含有体积分数为10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 mg/mL链霉素的F-12和DMEM培养基，于37 ℃、含体积分数5%的CO2恒温箱中培养。细胞传代时胰蛋白酶消化，800～1 000 r/min离心3～5 min。

1.3 克隆形成实验检测滇重楼皂苷对PC-3和Du145克隆增殖的影响将细胞以500个/孔的密度接种在6孔板中，连续培养3 d后加入含浓度为0.1 μmol/L滇重楼皂苷的完全培养基，每2～3 d换液1次，培养7 d后吸出培养液，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)洗涤3次，加入预冷无水甲醇溶液固定10 min后加入2.5 g/L结晶紫溶液染色10 min，流水将残余溶液洗去后晾干、拍照，在显微镜下计数细胞克隆数(大于50个细胞的细胞群)，计算细胞克隆形成率。

1.4 MTT检测PC-3、Du145细胞增殖抑制率取对数生长期PC-3、Du145以6 000个/孔种于96孔板中。实验组及对照组均设5个重复孔，四周孔使用PBS填充。过夜培养后吸出培养液，将含体积分数为0.1%DMSO的完全培养基加入对照组中，实验组加入终浓度为0.1、0.3、1.0、3.0、10.0 μmol/L的含滇重楼皂苷的培养基100 μL，分别孵育24、48、72 h后加入5 mg/mL的MTT溶液10 μL，孵育4 h后吸出液体，使用100 μL的DMSO溶解结晶，震荡5 min后于570 nm、630 nm处检测吸光度，计算细胞活性率。

1.5 流式细胞术检测细胞周期PC-3、Du145按3×105个/孔接种于6孔板中培养24 h，加入梯度为0.1、0.3、1.0 μmol/L的含药完全培养基，阴性对照孔加入含有体积分数为0.1%的DMSO培养基，24 h后收集细胞，PBS洗2遍，重悬后加预冷体积分数为75%的乙醇于4 ℃固定12 h以上，1 000 r/min离心去上清，用预冷PBS洗2次后加入RNase和PI染液37 ℃孵育30 min，离心后用PBS重悬细胞上机(BD，Biosciences,USA)检测细胞周期。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡将PC-3、Du145以6×105个/孔接种于6孔板中培养24 h后，加入最终浓度梯度为1、3、5 μmol/L的含药完全培养基，阴性对照孔加入含有0.1%DMSO的培养基，12 h后收集细胞，使用Annexin V-FITC流式凋亡盒检测，流式细胞仪分析细胞凋亡。

1.7 Western blotting检测p21、p-CDK2、p-RB以及Caspase-3蛋白的表达将PC-3、Du145细胞以6×105个/孔接种于6孔板中培养24 h后，加入最终药物浓度梯度为0.1、0.3、1.0 μmol/L，对照孔加入含有体积分数为0.1%的DMSO培养基，培养24 h后加入RIPA细胞裂解液，冰上裂解30 min，吸取裂解产物至1.5 mL离心管中，低温13 000 r/min离心5 min，吸取上清为细胞总蛋白。使用聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchoninic acid，BCA)法蛋白浓度定量试剂盒测定蛋白浓度，将各组蛋白浓度调节至相等。使用10% SDS-PAGE凝胶进行电泳。每组加入30 μg蛋白以90 V电泳10～20 min，待marker分层后使用120 V电泳45 min，对目的蛋白分离后进行180 mA湿转45 min，再用50 g/L脱脂牛奶室温下封闭1 h。加入一抗后4 ℃过夜孵育。第2天吸出一抗，用TBST洗45 min后加入二抗孵育1 h。洗膜后加入电化学发光(electrochemiluminescence，ECL)发光液，反应5 min后放入化学发光成像仪(Invitrogen,USA)中检测目的蛋白。

2 结 果

2.1 滇重楼皂苷使前列腺癌细胞集落形成减少克隆形成实验结果显示，滇重楼皂苷(0.1 μmol/L)处理后PC-3和Du145细胞的克隆形成集落少于对照组(图1A)，与对照组相比实验组克隆形成率下降，差异有统计学意义(图1B)。表明滇重楼皂苷具有抑制前列腺癌细胞克隆形成的能力。

A：含0.1 μmol/L的滇重楼皂苷培养基与对照组PC-3和Du145细胞克隆形成集落的对比，结晶紫染色；B：PC-3和Du145细胞克隆形成率[克隆形成率=(克隆数/接种细胞数)×100%]；与对照组相比，***P<0.001。图1 滇重楼皂苷对PC-3和Du145细胞克隆形成的抑制作用

2.2 滇重楼皂苷抑制前列腺癌细胞增殖的作用随着滇重楼皂苷浓度和作用时间的增加，MTT结果显示PC-3、Du145细胞活性明显降低，表明其对前列腺癌细胞的增殖抑制作用具有时间-剂量依赖效应。作用时间在72 h时达到最佳的抑制效果(图2)。经统计分析，滇重楼皂苷在PC-3、Du145细胞株中的半数抑制率(IC50)分别为3.0、5.7 μmol/L。

A：PC-3；B：Du145。[细胞活性率=(实验组A值/对照组A值)×100%]，与对照组相比，*P<0.05。图2 不同浓度滇重楼皂苷在不同时间下对前列腺癌细胞增殖的抑制作用

2.3 滇重楼皂苷对细胞周期的影响经过滇重楼皂苷处理24 h后，可见随着药物剂量的上升，实验组细胞G0/G1期比例逐渐升高，S期与G2期比例下降(图3A)。在1 μmol/L时滇重楼皂苷抑制效果最好，前列腺癌细胞G0/G1期比例达到80%以上，与对照组相比差异有统计学意义(图3B)，表明滇重楼皂苷具有阻断细胞G0/G1期的作用。

A：PC-3；B：Du145。与对照组相比，*P<0.05；**P<0.01。图3 不同浓度的滇重楼皂苷对前列腺癌细胞周期分布的影响

2.4 滇重楼皂苷促进前列腺癌细胞株发生凋亡用不同浓度的滇重楼皂苷(1、3、5 μmol/L)分别处理PC-3和Du145细胞12 h(图4A)，结果显示各剂量组可明显升高细胞凋亡率(P<0.05)，与对照组比差异具有统计学意义(图4B)。

A:流式细胞术检测凋亡，滇重楼皂苷各个浓度可促细胞凋亡；B:PC-3和Du145细胞凋亡率[细胞凋亡率%=晚期凋亡细胞率%+早期细胞凋亡率%]，与对照组相比，*P<0.05。图4 滇重楼皂苷诱导PC-3、Du145细胞凋亡

2.5 滇重楼皂苷对p21、p-CDK2、p-RB蛋白和凋亡蛋白的影响使用滇重楼皂苷(0.1、0.3、1.0、3.0 μmol/L)分别处理PC-3和Du145细胞24 h后，Western blotting检测p21waf/cip1、pho-RB(Ser795)、pho-CDK2(Thr160)和Caspase-3蛋白的表达情况。结果显示p21蛋白含量增高，细胞周期相关蛋白p-CDK2、p-RB降低，凋亡剪切酶Caspase-3含量增多，且呈剂量依赖趋势。在3 μmol/L浓度下，p-RB的表达几乎被完全抑制(图5)。

图5 不同浓度滇重楼皂苷对细胞周期相关蛋白p21、p-CDK2、p-RB和凋亡蛋白Caspase-3的影响

3 讨 论

前列腺癌是老年男性最常见的肿瘤，2018年全世界约有130万确诊病例，导致近36万人死亡。常用的治疗手段包括手术去势、内分泌治疗、放化疗和靶向治疗，这些治疗方式的出现大大改善了前列腺癌患者的预后，但晚期或转移性前列腺癌患者的5年生存率仅为26%～30%，因此需要有新的药物能有效控制前列腺癌[11]。中医临床使用滇重楼根茎已有数千年历史，滇重楼皂苷是滇重楼根茎中提取的活性成分之一。研究者发现滇重楼皂苷具有抑制肿瘤细胞生长、抑制肿瘤血管生成[12]、逆转耐药性[13]、抑制炎症反应[14]和调节免疫功能的作用，在治疗癌症方面极具前景。

细胞周期失调是癌症的一个特性[15]。细胞周期蛋白依赖性激酶2(cyclin-dependent kinase 2，CDK2)是调控细胞G1-S期的重要蛋白，它以磷酸化的形式参与细胞周期进程、DNA复制、组蛋白合成以及中心体复制[16-17]。当细胞受到有丝分裂信号刺激时，将激活细胞周期蛋白E(cyclin E)，随后激活CDK2并形成复合体，CDK2-cyclinE复合体可使RB磷酸化，从而促进转录因子协调的基因表达，推动细胞周期的进程[18]。作为CDK2的调控基因，p21可以抑制CDK2的活性，阻止RB进一步磷酸化和DNA复制启动，使细胞周期停滞在G1期[19]。

在胃癌及非小细胞肺癌中，滇重楼皂苷在浓度很低(0.1、0.5 μmol/L)的时候即可抑制细胞增殖[20-21]。本研究中，我们在克隆增殖实验中发现滇重楼皂苷在0.1 μmol/L浓度下即可抑制前列腺癌细胞的克隆增殖，因此我们在后续实验中使用0.1 μmol/L作为起始浓度，并以3倍浓度梯度递增。当滇重楼皂苷浓度增至10 μmol/L时可使细胞发生大量坏死，因此我们选择1、3、5 μmol/L作为凋亡实验的剂量。本研究结果显示，前列腺癌细胞活力在递增浓度和时间的滇重楼皂苷作用下，呈浓度-时间依赖的下降趋势。流式技术结果示，滇重楼皂苷在低剂量(1、3 μmol/L)下，使PC-3和Du145细胞G0/G1期比例升高，S期占比下降，且G0/G1期比例随着药物浓度的增加，呈上升趋势。当前列腺癌细胞在滇重楼皂苷高剂量(5 μmol/L)的作用下出现明显凋亡，凋亡细胞所占比例呈浓度依赖性增高。为阐明滇重楼皂苷诱导前列腺癌细胞发生周期阻滞和凋亡的可能机制，我们进一步对相关细胞周期蛋白和凋亡通路蛋白进行检测。结果显示，PC-3和Du145在滇重楼皂苷的作用下，p21表达显著上升，而p-CDK2和p-RB的表达下降。并且细胞发生凋亡中最重要的终末剪切酶Caspase-3[22]出现明显裂解激活。以上结果提示，滇重楼皂苷具有激活细胞凋亡通路和抑制p21调控CDK2/RB通路的作用。

综上所述，滇重楼皂苷能够通过调节p21/CDK2/RB信号通路和激活细胞凋亡蛋白，从而抑制前列腺癌细胞株的增殖和生长、诱导细胞凋亡，为滇重楼皂苷运用于前列腺癌临床治疗提供了理论依据。但滇重楼皂苷激活p21的具体机制及其在前列腺癌动物模型中的抗肿瘤活性仍需进一步研究。