HBV相关原发性肝癌患者T淋巴细胞亚群和细胞因子表达水平差异研究

陈锡莲 杨勇卫 林静 李彩东 刘友德 邹志强

1烟台市奇山（传染病）医院科教科，山东 246001；2烟台市奇山（传染病）医院检验科，山东 246001；3甘肃省肿瘤医院医学情报研究所，兰州 730050；4兰州市第二人民医院肝病研究所 730046；5烟台市奇山（传染病）医院肝病二科，山东 246001

T 淋巴细胞亚群和细胞因子在乙型病毒性肝炎（HBV）的发病中起重要作用［1］。HBV 感染的结局从自限性肝炎、慢性肝纤维化、肝硬化（LC）到肝癌不等。因此，探究慢性HBV 感染患者外周血或者肝源性的T 细胞亚群和相关细胞因子组成，是研究HBV 免疫病理机制的重要方法［2］。T 淋巴细胞在调节机体的免疫应答、维持自身免疫耐受和内环境稳定方面起重要作用［3］。细胞因子以旁分泌和（或）自分泌的方式直接作用于其所生成的微环境［4］。目前国内外研究T 淋巴细胞（CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+）和细胞因子［白细胞介素（IL）-6、IL-17、IL-27、肿瘤坏死因子（TNF）-α］的表达水平与原发性肝癌（HCC）发生相关性的报道尚不多见，本研究选取173例慢性HBV 感染者，依据临床分型分组讨论其外周血T 淋巴细胞和细胞因子的表达水平，深入探讨原发性肝癌的发病机理，旨在为阐明HBV 感染后慢性化机制提供数据支持和临床依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 健康对照组：2017 年9 月至2020 年5 月烟台市奇山医院体检中心健康查体者40 例，排除各型肝炎病毒感染，排除心肺疾病等，肝功能正常。其中男25例，女15 例，年龄范围为23～58 岁，年龄（39.15±14.95）岁。2017 年9 月至2020 年5 月在烟台市奇山医院住院及肝病专家门诊收治的173例HBV 感染者，所有患者排除甲、丙、丁、戊等肝炎病毒感染，排除自身免疫性肝炎、酒精性肝炎、药物性肝炎等疾病，男114 例，女59 例，年龄范围为11～73 岁，年龄（45.38±12.72）岁；其中原发性肝癌患者22 例（HCC 组），乙肝肝硬化患者41 例（LC 组），慢性乙型肝炎患者51 例（CHB 组），慢性乙型肝炎病毒携带者59 例（ASC组）。诊断符合2015 年中华医学会肝病学会和中华医学会感染学会联合制定的《慢性乙型肝炎诊治指南》［5］中的诊断标准。

本研究经烟台市奇山医院医学伦理委员会批准（202003号），所有研究对象签署知情同意书。

1.2 检测方法

1.2.1 T 淋巴细胞检测方法 取5 组研究对象的空腹血清标本2 ml，乙二胺四乙酸二钾（EDTAK2）抗凝，在样品测定管中加入50 μl抗凝血，然后加入20 μl单抗（CD4FITC/CD8PE/CD3PerCP/CD4FITC/CD25PE，均 购 自 美 国BD 公司），及其同型对照IgG2bFITC/IgG1PE（购于天津协科生物技术有限公司）振荡混匀，室温避光孵育20 min，加入2.0 ml溶血素，振荡混匀，室温避光放置15 min。1 500 r/min（离心半径15 cm），离心5 min，弃上清液。加入2.0 ml 胎牛血清，1 500 r/min（离心半径15 cm），离心5 min，弃上清液，重复1 次。加入500 μl 胎牛血清，上机（美国Becton-Dickinson公司FACSV Verse 流式细胞分析仪）检测。全部数据用流式细胞仪和BD FAC Suite 软件系统进行荧光参数获取和分析。

1.2.2 细胞因子检测方法 采用ELISA 法，试剂盒购自上海朗顿生物科技有限公司，严格按照说明书要求操作，使用科华ST-360酶标仪检测。

1.2.3 HBV DNA 检测方法 无菌采集5 组研究对象的空腹血清标本2.0 ml，注入无菌离心管，室温保存2 h，1 600 r/min离心5 min（离心半径15 cm），吸取离心管中血清200 μl，转入另一无菌1.5 ml 离心管。最后取5 μl 血清，用于DNA 提取。采用美国ABI-7500 荧光定量PCR 分析仪进行基因扩增，试剂购自广州达安生物科技有限公司。结果判断：＜102IU/ml 为阴性，102～104IU/ml 为低载量组，105～106IU/ml为中载量组，＞107IU/ml为高载量组。

1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0 统计软件进行统计分布，计量资料符合正态分布，数据以均数±标准差（±s）表示，组间方差不齐采用Welch 方差分析，两两比较采用Games-Howell 检验，多组间及进一步两两比较采用Kruskal-WallisH检验，计数资料组间比较采用χ2检验，相关性分析采用Spearman 秩相关分析法，相关系数用r表示，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同临床分型患者T淋巴细胞亚群表达水平 慢性HBV感染者CD3+水平从ASC组到HCC组逐渐降低，其中HCC 组最低，其次为LC 组，与健康对照组相比，P＜0.05；慢性HBV 感染者外周血CD3+CD4+水平均不同程度升高，LC组最高，但差异无统计学意义（P＞0.05）；LC 组患者外周血CD3+CD8+水平最低，与其他组相比，均P＜0.05。见表1。

表1 HBV感染者与健康对照组的T淋巴细胞亚群占淋巴细胞百分比（%）

2.2 HCC 组T 淋巴细胞亚群水平与HBV DNA 水平的相关性 HBV DNA 水平与CD3+和CD3+CD8+呈负相关（r=-0.232，P＜0.05；r=-0.220，P＜0.05）。

2.3 不同临床分型HBV 感染者细胞因子表达水平分析 与健康对照组相比，ASC 组、CHB 组、LC 组和HCC 组外周血IL-6、IL-17、IL-27 和TNF-α 水平均显著升高（均P＜0.01）；其中HCC 组IL-6 水平最低，ASC 组IL-17 水平最低、IL-27 水平最高，与慢性HBV 感染者其他各组相比，差异均有统计学意义（均P＜0.01）；ASC 组TNF-α 水平最低，与LC组相比，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表2。

表2 HBV感染者及健康对照组的细胞因子水平（ng/L，± s）

表2 HBV感染者及健康对照组的细胞因子水平（ng/L，± s）

注：HBV 为乙型肝炎病毒，HCC 为原发性肝癌，LC 为肝硬化，CHB 为慢性乙型肝炎，ASC 为慢性乙型肝炎病毒携带者，IL 为白细胞介素，TNF为肿瘤坏死因子；与健康对照组相比，aP＜0.01，与ASC组相比，bP＜0.01，与CHB组相比，cP＜0.01，与LC组相比，dP＜0.01

TNF-α 85.68±36.16a 107.60±33.64a 81.44±26.64a 65.37±24.89ad 32.57±16.58 3.52＜0.001组别HCC组LC组CHB组ASC组健康对照组H值P值例数22 41 51 59 40 IL-6 52.34±13.16abcd 75.26±10.45a 80.87±10.97a 95.31±12.46a 25.68±5.52 3.46＜0.001 IL-17 16.04±8.65ab 23.26±15.17ab 21.63±6.54ab 8.75±4.34a 4.44±2.34 1.13＜0.001 IL-27 115.07±38.63ab 104.21±31.15ab 116.31±32.53ab 194.35±43.18a 50.10±17.81 1.66＜0.001

2.4 HCC 组细胞因子表达水平与HBV DNA 水平的相关性 HCC 患者外周血IL-27 和TNF-α 水平均与HBV DNA 呈负相关（r=-0.359，P=0.019；r=-0.367，P=0.017；r=-0.348，P=0.024）。

3 讨 论

乙型肝炎是一种免疫相关性疾病，机体感染HBV 后，外周血中各淋巴细胞亚群间的平衡被打破［6-8］。有研究表明，慢性HBV 感染者普遍存在T 淋巴细胞衰竭［9］。本研究发现：慢性HBV感染者CD3+水平从ASC组到HCC组逐渐降低，其中HCC 组患者最低，其次为LC 组患者（P＜0.05）；与健康对照组比，慢性HBV 感染者外周血CD3+CD4+水平均升高，LC 组最高（P＞0.05）；LC 组CD3+CD8+水平最低（P＜0.05），提示机体被HBV 持续感染时，T 细胞免疫功能衰退，其中CD8+T 细胞更易衰竭。有研究表明，HBV DNA 载量与CD3+、CD4+、CD4+/CD8+均呈负相关，HBV DNA 的载量与CD8+呈正相关，提示HBV DNA 载量增加可进一步导致乙肝患者细胞免疫功能紊乱加重，可通过抑制HBV 的复制，改善机体细胞免疫功能［10-13］。本研究显示：HCC 组HBV DNA水平与CD3+和CD3+CD8+呈负相关（P＜0.05）；推测HBV 感染后，体内病毒会不断复制，外周血T 淋巴细胞亚群平衡被打破，细胞免疫功能下降，使机体无法有效清除HBV，从而导致慢性HBV 感染和病毒的持续存在。此外，还可以通过观察患者HBV DNA 载量来推测T 细胞亚群的表达水平，从而分析患者的免疫反应，对指导抗病毒药物的使用起到积极的作用。

IL-6 可能参与了病毒性肝炎的免疫损害［14-15］。本研究结果显示：与健康对照组相比，HBV 感染者各组外周血IL-6 水平均显著升高（均P＜0.01），提示IL-6 与乙型肝炎的发病和病情进展密切相关，在LC 组中，作为一种抗炎细胞因子，能平衡促炎细胞因子或早期细胞因子的损伤作用，起到保护作用。Th17在肝脏炎性损伤中发挥的作用鲜有报道，IL-17 是Th17 细胞分泌的重要细胞因子之一，具有促炎症作用，可诱导基质金属蛋白酶趋化因子和促炎细胞因子的表达，参与中性粒细胞的增殖成熟和趋化，引起组织细胞浸润和破坏，对T 细胞的活化亦起协同刺激作用［15］。本研究发现：与健康对照组相比，HBV 感染者各组血清IL-17 水平均显著升高（均P＜0.01），这与王妍等［16］研究基本一致，提示血清IL-17 随着乙型肝炎病程的进展其表达也增强。HBV感染后的肝损伤是指机体抗病毒反应引起的肝细胞免疫损伤，以大量炎性细胞浸润和肝实质细胞变性坏死为特征。研究证实，IL-27 一方面是Th1 类型免疫反应的起始者，另一方面又能削弱免疫/炎性反应［17-18］。本研究发现：与健康对照组相比，HBV 感染者各组外周血IL-27 水平均显著升高，其中ASC组IL-27水平最高（P＜0.01）；HCC患者外周血IL-27 水平与HBV DNA 呈负相关（P＜0.05）。提示IL-27 参与了肝脏疾病及原发性肝癌的发生、发展过程，在乙肝病毒感染过程中，能减弱炎性反应，减轻乙肝病毒对肝脏器官的损害。TNF-α在肝硬化的发生发展中参与肝脏的损伤与修复循环，肝纤维化程度越明显，肝组织内TNF-α含量越高［19］。本研究发现：与健康对照组比较，慢性HBV 感染者各组外周血TNF-α水平均显著升高，其中LC组TNF-α水平最高，ASC 组最低；HCC 患者外周血TNF-α 水平与HBV DNA 载量呈负相关（P＜0.05）；提示慢性HBV 感染者体内存在不同程度的炎性反应，乙肝病毒直接诱发TNF-α增高，TNF-α在末期肝病的发生发展中发挥重要作用。

总之，HBV 感染的消除或持续进展与机体的免疫功能密切相关。免疫细胞和细胞因子的数量减少，不能有效介导免疫应答，清除体内病毒，导致肝细胞不断受损。本研究仍有许多问题有待进一步研究：（1）HBV 感染过程中T 细胞和细胞因子免疫功能的具体机制；（2）免疫功能的激活是一把双刃剑，如何把握药物调节免疫功能的程度？进一步研究可为HBV感染者的发病机制和个体化治疗提供新策略。

利益冲突：作者已申明文章无相关利益冲突。