芹菜素对人牙髓间充质细胞增殖和成骨分化的影响

汪芹芹，徐 燕，胡韶光，刘珂珂， 桂双英

牙周炎是导致牙周组织缺损的重要因素之一，随着再生医学和牙周组织工程的发展，以自体来源的种子细胞复合生物材料植入牙周病损部位，修复牙周缺损受到越来越多学者的关注。但是，如何获取大量种子细胞仍是一个难题。芹菜素(4′,5,7,-三羟基黄酮)是一种黄酮类化合物，无毒且无致突变性,还有抗炎、抗氧化、抗病毒活性及抗肿瘤等药理作用。许周媚 等证实了芹菜素可显著促进 MC3T3-E1细胞成骨分化和矿化。人牙髓间充质细胞(human dental pulp mesenchymal stromal cells，hDPSCs)来源丰富、取材方便、免疫排斥小。该研究通过观察黄酮类化合物芹菜素对hDPSCs增殖及骨向分化的影响，探讨芹菜素用于辅助治疗牙周病等骨缺损疾病的可能性。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

芹菜素(美国MCE公司)；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(美国Gibco公司)；DMEM培养基(美国Hylcone公司)；Countstar细胞计数仪(上海睿钰生物科技有限公司)；细胞培养箱、JJT-900超净台(美国Thermo公司)；荧光倒置显微镜(DMI3000B，德国Leica公司);Elx808U酶标仪、BCIP/NBT碱性磷酸酯酶试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；茜素红染液(美国Sigma公司)；Bio-oss骨粉(瑞士Geistlich公司)；扫描电镜(Hitachi S-4800，日本日立公司)。

1.2 实验药物

将适量芹菜素粉末溶于100 μl DMSO中获得10 mmol/L芹菜素溶液，0.22 μm过滤除菌,-20 ℃保存。使用时用培养基稀释成实验所需浓度。

1.3 实验动物

普通级新西兰兔10只，雌雄不限，2.25～2.75 kg，日龄90～120 d。由安徽医科大学动物中心提供并饲养。经安徽医科大学实验动物伦理委员会批准(编号：LLSC20190122)。

1.4 hDPSCs分离培养与传代

从安徽省口腔医院口腔颌面外科收集健康的离体第3磨牙，患者年龄18～35(23.4±5.10)周岁。在超净工作台中用无菌PBS冲洗离体牙后劈开牙冠，取出牙髓组织，剪碎成 1 mm×1 mm×0.5 mm大小组织块移入6孔板中，每孔3～5小块组织。盖玻片盖于组织块上，轻轻加压固定，防止气泡产生影响细胞的爬出。于37 ℃、5% CO条件下进行原代培养，当细胞从组织块周围爬出并达孔底面积60%左右时，0.25%胰蛋白酶消化后进行传代培养。

1.5 hDPSCs的鉴定

倒置显微镜下观察细胞形态。取第2代细胞，5个流式管，每管1×10个细胞。4 ℃下1 000 r/min离心5 min后去上清液，无菌PBS溶液洗涤1次。每管用100 μl PBS重悬细胞沉淀，按照抗体说明书分别加入CD34、CD45、CD44、CD73抗体，设置1个空白对照管，混匀后在4 ℃避光孵育30 min。PBS溶液洗涤2次后重悬，上流式细胞仪检测。

1.6 CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况

取第3代细胞，接种于3个96孔板，细胞密度为3×10/孔。分无芹菜素组及含不同浓度芹菜素(0.1、1、5、10、50 μmol/L)的实验组，每组设5个复孔。于37 ℃、5% CO恒温培养箱内培养，24 h后换液。分别在第1、2、3天按照CCK-8试剂盒说明书操作，用酶标仪测定450 nm处吸光度值(optical density，OD)。使用GraphPad Prism 6作图。

1.7 细胞成骨诱导及成骨能力检测

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7

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1

碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性的测定 成骨诱导液配置：10 μmol/L地塞米松，50 mg/L维生素C，10 mmol/L β-甘油磷酸钠。取第3代细胞，以5×10/孔的密度接种于3个96孔板，每组设5个复孔，分为无芹菜素组，成骨诱导液组(OIM)及含不同浓度芹菜素(0.1、1、5、10、50 μmol/L)的成骨诱导液组，24 h后换液，后每3 d换液，分别在培养的第1、4、7天按照碱性磷酸酯酶试剂盒具体流程进行检测。

1.7.2 ALP染色

根据上述结果，选择浓度为5 μmol/L的芹菜素进行后续实验。实验分为3组：对照组为DMEM液组；矿化组为成骨诱导液组；实验组为5 μmol/L芹菜素成骨诱导液组。取生长状态良好的第3代细胞，以5×10/孔的密度接种于6孔板，每组设2个复孔，24 h后换成以上3组培养液，后每3 d换液，培养至14 d。按照ALP显色试剂盒说明书进行染色。

1

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7

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3

茜素红染色 实验分为3组：同ALP染色。将细胞接种于6孔板，5×10/孔，每组设2个复孔，24 h换成以上3组培养液，后每3 d换液，培养至21 d；用4%的多聚甲醛溶液固定30 min；弃固定液，PBS清洗后，加入茜素红染液，染色30 min。

1.8

Real-time

PCR

取第3代细胞在6孔板中培养，5×10/孔，每组设2个复孔，7 d后使用TRIzol裂解细胞，收集并检测RNA浓度，浓度合适后使用Prime-ScriptRT Master Mix系统逆转录合成cDNA。以cDNA作为模板，β-actin为内参，上PCR仪检测，全程严格按照试剂说明书操作。引物序列见表1。

表1 Real-time PCR引物及其序列

1.9 动物实验

1

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1

骨粉与hDPSCs复合物的制备 选用第3代hDPSCs，以1×10/ml 细胞高浓度接种于骨粉支架上，放在50 ml离心管，低速震荡，孵育2 h后转移到24孔板，分别加入普通DMEM培养基和含5 μmol/L芹菜素的培养基，置于恒温培养箱培养，培养3 d后扫描电镜观察复合物情况。

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2

显微镜观察复合物 用PBS洗涤2次，2.5%戊二醛溶液固定2 h后弃固定液，再用PBS洗涤3次，每次20 min；后续依次加入50%乙醇溶液、60%乙醇溶液、70%乙醇溶液、80%乙醇溶液、90%乙醇溶液，每个浓度各洗20 min；然后加入100%乙醇溶液、洗2次，每次20 min。使用临界点干燥仪干燥样本，送样进行表面喷金，扫描电镜下观察。

1

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3

动物模型的制备 实验兔称重后用3%戊巴比妥钠行耳缘静脉麻醉(1 ml/kg),将兔子俯卧位固定在手术台，术前头部剃毛，消毒，铺巾，在颅顶正中部位切开至骨膜，剥离骨膜，显露骨面。剥离范围向前至鼻根点处，向后方至枕骨结节。沿冠状缝、矢状缝将颅骨分成四个区域，每个区域造直径8 mm的圆形全层骨缺损；随机分成4组：空白组、骨粉组、普通培养的hDPSCs复合骨粉组、5 μmol/L芹菜素培养的hDPSCs复合骨粉组。全程用灭菌生理盐水降温。术后肌注抗生素3 d，伤口涂抹红霉素软膏预防感染。

1

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4

Micro-CT分析 术后4、8 周处死实验兔，方法为麻醉后空气栓塞处死，取出颅骨缺损处组织，范围在缺损外2 mm处，进行Micro-CT扫描。扫描电流500 mA，电压80 kv，扫描完成后将数据直接导入系统中，进行骨体积分数分析，计算得出缺损区BV/TV值，并使用GraphPad Prism 6作图。

1

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10 统计学处理

采用SPSS 22.0软件进行数据分析，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用

t

检验，

P

<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 hDPSCs的培养与鉴定

原代细胞5 d左右开始爬出，12 d左右达到孔底的60%左右。贴壁的hDPSCs大部分为长梭形，与成纤维细胞类似(图1)，流式细胞仪对hDPSCs进行表面抗原的检测，结果显示阳性表达CD44(93.98%)、CD73(97.47%)；阴性表达CD34(0.01%)、CD45(0.00%)。符合间充质来源的特征(图2)。

图1 显微镜下原代培养及传代培养的细胞A:原代细胞 ×40 B:传代后细胞 ×100

图2 流式细胞仪检测结果

2.2 芹菜素对hDPSCs增殖的影响

CCK-8结果显示，0.1～10 μmol/L芹菜素对hDPSCs无明显的毒性作用，48 h时，与其他对照组比较，5 μmol/L芹菜素对hDPSCs增殖有显著促进作用，差异有统计学意义(

F

=14.640,

P

<0.001)，72 h时促进作用更明显，差异有统计学意义(

F

=33.843,

P

<0.001)。当剂量达到50 μmol/L时，芹菜素具有抑制hDPSCs增殖的趋势(图3)。

图3 CCK-8法检测细胞增殖情况与0 μmol/L芹菜素组比较:***P<0.001

2.3 成骨诱导后成骨能力检测结果

2

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3

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1

ALP活性表达情况 用ALP试剂盒检测培养1、4、7 d后的ALP活性水平。4 d时，与对照组比较，5 μmol/L芹菜素组细胞内ALP活性显著增高(

F

=310.121,

P

<0.001)；7 d时，OD值明显增高，差异有统计学意义(

F

=404.063，

P

<0.001)(图4)。

图4 ALP 定量分析与0 μmol/L芹菜素组比较：***P<0.001

2

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3

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2

茜素红染色 经过21 d的体外成骨诱导后，茜素红染色可见5 μmol/L芹菜素成骨诱导液组形成的钙结节数量较矿化组多，对照组未见明显的矿化结节形成(图5)。

图5 茜素红染色A：对照组；B：矿化组；C：实验组

2

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3

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3

ALP染色 经过14 d的体外成骨诱导后，镜下可见5 μmol/L芹菜素组与矿化组较对照组均有蓝紫色形成，且5 μmol/L芹菜素组颜色更深，范围更大(图6)。

图6 ALP染色 ×100A：对照组；B：矿化组；C：实验组

2.4 Real-time PCR结果

7 d成骨诱导后，5 μmol/L芹菜素组hDPSCs成骨相关基因OCN的mRNA相对表达量较对照组均增加，差异有统计学意义(

F

=25.747，

P

=0.005)；RUNX2 mRNA相对表达量较对照组增加，差异有统计学意义(

F

=46.791,

P

=0.002)(图7)。

图7 芹菜素对hDPSCs成骨向分化相关基因mRNA表达的影响A:Runx2; B:OCN; 与空白组比较：*P<0.05；与矿化组比较：#P<0.05

2.5 细胞骨粉复合物扫描电镜观察

扫描电镜观察到hDPSCs与骨粉复合培养3 d，细胞可黏附于骨粉存活并且伸出伪足(图8)。

图8 扫描电子显微镜下观察hDPSCs/Bio-oss复合物 ×6 130

2.6 兔颅骨造模

4个区域按照8 mm直径造4个圆形全层骨缺损，用有刻度的探针测量直径，依次放好移植物后缝合(图9)。

图9 术区大体观A：颅骨缺损造模；B：完整取出骨组织块；C：放置细胞支架复合物；D：缝合

2.7 Micro-CT 结果

术后4周骨体积分数检测显示，与普通培养的hDPSCs复合骨粉组比较，5 μmol/L芹菜素培养的hDPSCs复合骨粉组骨体积分数较大，空白组及骨粉组无明显新骨形成，差异有统计学意义(

F

=94.389,

P

<0.01);术后8周骨体积分数检测显示，5 μmol/L芹菜素培养的hDPSCs复合骨粉组新骨形成较普通培养的hDPSCs复合骨粉组多，差异有统计学意义(

F

=38.139,

P

<0.01)，空白组及骨粉组形成少量新骨(图10)。

图10 兔颅骨缺损区骨体积分数(BV/TV)与普通培养的hDPSCs复合骨粉组比较：**P<0.01

3 讨论

组织工程的原理是在体外培养种子细胞，使种子细胞具有强大的增殖和分化能力，然后将它们与生物材料复合植入病变区域，以恢复缺损组织的形态和功能。牙周再生组织工程同样如此，由于牙周炎，牙周缺损暴露于口腔中复杂的微生物环境中，不利于机体自身产生大量的种子细胞。因此体外刺激细胞增殖和分化是必要的。来源于牙髓的细胞具有无创伤、易于分离、增殖率高等优势，可以从第三恒磨牙、正畸牙或其他原因拔除的健康牙的牙髓组织中分离培养获得，而不受伦理问题的影响。选用hDPSCs，不仅有来源广泛、取材简便、体外易培养等优点，且细胞来源于患者自身，更减少了免疫排斥反应。有研究显示芹菜素可以通过产生膜孔诱导真菌凋亡发挥显著的抗真菌活性。也有研究表明芹菜素可通过减少氧化应激抑制过度活跃的自噬和凋亡来缓解与年龄相关的骨骼肌的萎缩。以上研究证明了芹菜素的抗菌抗氧化的药理作用，对于牙周炎患者来说，抗菌抗炎治疗也是必不可少的，因此，芹菜素的这些药理作用更能保障牙周再生过程的顺利进行。

本实验探讨黄酮类化合物芹菜素对hDPSCs增殖和成骨分化的影响。通过改良组织块法体外培养人的健康牙髓组织，获得hDPSCs。流式细胞仪检测细胞表面抗原CD34、CD45、CD44、CD73，证明培养的细胞属于间充质来源。利用CCK-8法检测不同浓度芹菜素(0.1、1、5、10、50 μmol/L)对hDPSCs增殖的影响，结果显示5 μmol/L的芹菜素对hDPSCs增殖影响最优，且与对照组差异有统计学意义(

P

<0.001)；ALP活性水平是成骨细胞分化成熟的早期标志之一，ALP活性测定结果显示5 μmol/L芹菜素作用后活性显著提高(

P

<0.001)；茜素红染色结果显示5 μmol/L芹菜素组钙结节的数量明显增多，ALP染色镜下见5 μmol/L芹菜素组颜色明显加深。Real-time PCR结果显示5 μmol/L芹菜素组RUNX2和OCN的mRNA表达明显上调。

以上实验室结果均证明5 μmol/L芹菜素可以促进hDPSCs的增殖和成骨向分化，为了进一步证明，将含有5 μmol/L芹菜素培养的hDPSCs与Bio-oss骨粉复合，置于兔颅骨缺损区。4、8周后取出缺损区标本，测量骨体积分数，含5 μmol/L芹菜素培养的hDPSCs复合骨粉组形成的新骨较其他对照组更多。本实验选择Bio-oss骨粉复合细胞，是希望骨粉能在新骨形成过程中起到支架的作用，为成骨过程提供空间结构，能更好的促进成骨。

综上所述，芹菜素能促进hDPSCs的增殖和成骨向分化，5 μmol/L芹菜素培养的hDPSCs复合骨粉能促进新西兰兔颅骨缺损的修复。但分子调控机制有待进一步研究。此外，本研究可以为后续治疗牙周骨缺损等疾病及制备原位液晶缓释递药系统提供思路。