不同方法提取黑果枸杞花色苷效果比较

李国秀 王晶金 高婷彦 郑浩睿 唐 琳

（四川大学生命科学学院，四川 成都 611100）

黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）为茄科枸杞属植物，果实中富含大量的花色苷，具有抗氧化、抗衰老、降血脂等功效。

目前国内外实验室花色苷提取的常用方法：有机溶剂萃取法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法和生物酶辅助提取法。双水相萃取花色苷是近年随着生物学的发展兴起的一种新型提取方法。与常用方法相比，双水相萃取花色苷具有诸多优点，如一步实现提取分离，提取条件温和，经济节约等。在目前报道中，常使用水/乙醇/无机盐双水相系统萃取植物材料中的花色苷类物质，花色苷倾向于向上相乙醇富集相分配，总糖类物质倾向于向下相盐富集相分配，从而达到提取分离目的。

常用花色苷提取方法辅助手段单一，本文采用超声波与纤维素酶两种辅助手段提取黑果枸杞花色苷。本文中双水相萃取法使用的无机盐硫酸铵与磷酸二氢钠均为弱酸性盐，与无水乙醇所形成的双水相体系呈酸性，刚好符合花色苷在酸性条件下更加稳定的特性。

目前关于黑果枸杞中花色苷的双水相萃取研究鲜见报道；与常用提取方法相比，双水相萃取黑果枸杞花色苷成分变化分析未见报道。基于研究现状，本文以花色苷含量、多糖去除率、花色苷色价和花色苷成分分析为指标多方面比较双水相萃取和超声酶辅助提取花色苷的效果。

1.材料与方法

1.1 材料与仪器

以青海地区的黑果枸杞为实验材料，经四川大学生命科学学院白洁副教授鉴定为茄科枸杞属黑果枸杞。

纤维素酶(成都瑞芬思公司)；AB-8大孔树脂(上海紫铭试剂厂)；乙醇、盐酸、磷酸二氢钠、硫酸铵均为分析纯(成都市科龙试剂化工厂)；MS半微量电子精密分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；离心机H1850型(长沙湘仪离心机仪器有限公司)；UV1600紫外分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)；冷冻干燥机（宁波市鄞州仪器有限公司）；旋转蒸发器RE-52AA型（上海亚荣生化仪器厂）；PH计（希玛科技有限公司）；X500B Q-TOF液质联用仪（SCIEX公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 材料预处理

黑果枸杞干果烘干，粉碎，过40目筛，备用。

1.2.2 超声酶辅助提取黑果枸杞花色苷

1.00 g黑果枸杞粉末置于50 mL离心管中，依次加入25 mL 75%乙醇溶液、1.00 mg纤维素酶，用1% HCl(v/v)调节溶液pH为3.0，避光45℃超声辅助提取30 min；使用高速离心机4000 rpm/min，离心20 min，收集上清；将上清用70%酸性乙醇溶液（pH3.0）定容至100 mL，即得提取液。

1.2.3 双水相萃取黑果枸杞花色苷

一定质量分数的无机盐和去离子水加入50 mL离心管中，待无机盐完全溶解后，再加入一定质量分数的乙醇，使得溶液体系的总质量为48.00 g；1.00 g黑果枸杞粉末加入离心管中，45℃超声辅助提取一定时间（乙醇/硫酸铵体系：乙醇质量分数25%，硫酸铵质量分数23%，时间36 min。乙醇/磷酸二氢钠体系：乙醇质量分数24%，磷酸二氢钠质量分数为27%，时间37 min）。超声结束，4000 rpm/min，离心20 min，收集上下相溶液；将上下相溶液用70%酸性乙醇（pH=3.0）定容至100 mL，即得提取液。

1.2.4 总花色苷含量测定

花色苷含量的测定采用pH示差法：将提取液分别用pH1.0和pH4.5的缓冲溶液稀释10倍，在避光条件下平衡90 min。平衡结束，使用紫外分光光度计分别测定各提取液的平衡溶液在528 nm、710 nm波长下的吸光值。按以下公式计算所得黑果枸杞花色苷含量：花色苷含量(mg/g)=[(A528-A700)pH1.0-(A528-A700)pH4.5]×Mw×DF×V/(ε×L×m)，式中：Mw，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的相对分子质量，449.2 g/mol；DF—稀释因子；V—提取液的体积，100 mL；E—摩尔消光系数，29600 L/(mol·cm)；L—光程厘米数，1 cm；m—黑果枸杞粉末的质量，1.00 g。

1.2.5 花色苷色价测定

提取液在45℃条件下旋转蒸发，-80℃冷冻干燥24 h，得到紫黑色黑果枸杞花色苷样品。准确称取黑果枸杞花色苷样品1.00 g，采用pH3.0的70%乙醇进行稀释一定倍数，在528 nm处测其吸光值，用以下公式计算黑果枸杞花色苷色价：E=A×DF/W。式中：E—花色苷色价；A—吸光度值；DF—稀释倍数；W—黑果枸杞粉末质量。

1.2.6 多糖去除率测定

采用苯酚-硫酸法测定，绘制标准曲线：Y(吸光值)=71．266X(葡萄糖溶液浓度)+0.0301(R2=0.9982)。用以下公式计算多糖去除率：多糖去除率(%)=C下V下/(C上V上+C下V下)×100。式中：C上—上相中的总糖含量；C下—下相中的总糖含量；V上—上相溶液体积；V下—下相溶液体积。

1.2.7 花色苷的纯化

1.2.7.1 花色苷样品的准备

提取液45℃旋转蒸发，-80℃冷冻干燥，得到花色苷粗品。

1.2.7.2 AB-8大孔树脂纯化

准确称取1.00 g花色苷粗品溶于100 mL的80%酸化纯水中作为上样液，纯水用1% HCl预先调至pH3.0，控制流速为1.0 mL/min上样。待上样平衡后，用1% HCl调至pH3.0的80%乙醇溶液洗脱花色苷，待洗脱液开始有颜色时开始收集花色苷。对收集的花色苷纯化样品进行45℃旋转蒸发，然后-80℃冷冻干燥，备用。

1.2.8 UPLC-QTOF-MS/MS质谱分析花色苷成分

1.2.8.1 供试液的制备

取一定量“1.2.7.2”中得到的花色苷样品溶于50%色谱甲醇(0.1%甲酸，v/v)中，12000 rpm/min，离心5 min，然后过0.22 μm滤膜，相同的操作反复3次。

1.2.8.2 色谱条件和质谱条件

色谱条件：采用X500B Q-TOF液质联用仪的C18反 相 色 谱 柱(2.1 mm×100 mm，1.9 μm)；流 动 相：0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)；梯度洗脱条件为0-10 min，0%～20%B；10～15 min，20%～30%B；15～17 min，30%～95%B；流速0.4 mL/min；进样量3 μL。质谱条件：正离子模式检出，离子源温度500℃，m/z范围50～1200，离子化电压5500 V，喷雾气50 psi，辅助加热气50 psi，气帘气30 psi。

1.2.9 数据分析

实 验 重 复 三 次，采 用GraphPad Prism 5(GraphPad Software,USA)，实验结果以平均数±标准差表示(Mean±SD)进行数据分析。

2.结果与分析

2.1 基于花色苷含量比较

将超声辅助双水相萃取得到的花色苷含量与超声酶辅助提取得到的花色苷含量进行对比，发现三种方法均能对黑果枸杞中的花色苷进行有效提取。

表1 不同提取方法下花色苷含量对比Table 1 Comparison of color content of anthocyanins under different extraction methods

2.2 基于花色苷色价比较

表2 不同提取方法下花色苷色价对比Table 2 Comparison of color value of anthocyanins under different extraction methods

结果表明，两种双水相萃取得到的花色苷色价是超声酶辅助法的2倍。这可能是因为在双水相萃取过程中花色苷更倾向于上相水相中分配，多糖更倾向于下相无机盐相中分配，这使得通过双水相萃取得到的花色苷色价更高，意味着双水相萃取的花色苷纯度更高。

2.3 基于多糖去除率比较

乙醇/硫酸铵双水相萃取花色苷可以除去90.62%的多糖，乙醇/磷酸二氢钠双水相萃取可以除去82.16%的多糖。多糖被作为杂质被除去后，花色苷的纯度相应的增加，这与色价的比较结果形成了相互印证。

2.4 花色苷成分分析

采用超声酶辅助提取法和乙醇/硫酸铵、乙醇/磷酸二氢钠双水相萃取法提取的花色苷粗提液经过AB-8大孔树脂纯化后，分别进行UPLC-QTOF-MS/MS质谱鉴定，结果见表3。在相同的色谱条件和质谱条件下，相同的保留时间，三种提取方法下经过大孔树脂纯化的花色苷均鉴定出了15种相同的花色苷。在其他保留时间下，未发现三种方法下提取的花色苷成分有差异。这说明了双水相萃取相比超声酶辅助法能够完全保留黑果枸杞中的花色苷。

表3 花色苷成分分析Table 3 Analysis of anthocyanins

3.结论

本研究采用超声酶辅助提取法和乙醇/硫酸铵、乙醇/磷酸二氢钠双水相萃取法提取黑果枸杞中花色苷，基于花色苷含量、花色苷色价、多糖去除率、花色苷成分分析对花色苷提取效果进行比较。

结果表明，双水相萃取花色苷含量与超声酶辅助法相比无显著差别，但是纯度提高了2倍。乙醇/硫酸铵双水相萃取花色苷可以除去90.62%的多糖，乙醇/磷酸二氢钠双水相萃取可以除去82.16%的多糖。在相同的色谱条件和质谱条件下和相同的保留时间，三种提取方法下经过大孔树脂纯化的花色苷均鉴定出了15种相同的花色苷。这说明了双水相萃取相比超声酶辅助法能够完全保留黑果枸杞中的花色苷。

通过本文研究，与超声酶辅助法相比，双水相萃取法更加适用于花色苷的提取，为双水相萃取黑果枸杞花色苷积累了基础资料。