长链非编码RNA A-30-P01019163对卵巢颗粒细胞βB2晶体蛋白表达的调控及对颗粒细胞增殖和凋亡的影响

刘胜楠， 李美慧， 李 励， 黄 玮， 张俊洁

海军军医大学第一附属医院妇产科，上海 200433

不孕症在成年育龄人群中的发病率逐年升高并呈年轻化趋势，我国不孕症发病率为7%～10%，病因主要为女方因素、男方因素和不明原因性不孕[1]。女性因素中常见原因包括子宫异常、激素水平异常及排卵障碍。近年来，国内外学者发现一些生物学因素与卵巢发育及排卵障碍密切相关[2-3]。虽然已有文献报道影响卵巢发育的原因，但是具体分子机制仍待进一步探究。

在影响卵巢发育的因素中，卵巢中颗粒细胞因素较为重要。卵泡发育、排卵过程及黄体形成都需要颗粒细胞参与，这体现颗粒细胞在卵巢发育中的重要性。颗粒细胞的功能直接影响女性的生殖功能，并与卵泡增殖、分化和凋亡等的 改变密切相关，直接影响卵泡发育和卵巢排卵[4-5]。

本课题组前期研究[6]发现，βB2晶体蛋白(βB2 crystallin，CryBB2)基因全敲雄性小鼠生殖能力降低，可能由生殖细胞增殖和凋亡紊乱所致。在CryBB2蛋白对卵巢初步作用研究[7]中发现，CryBB2表达于健康人及小鼠的卵巢中，在小鼠的卵巢颗粒细胞中表达，且CryBB2敲除小鼠的卵巢结构及功能显著有别于正常同龄小鼠。有研究[8]采用基因芯片、生物信息学分析及qRT-PCR等方法验证了lncRNA A-30-P01019163(lnc-9163)在CryBB2基因全敲小鼠卵巢组织中表达下调。本研究基于课题组前期实验结果，进一步探讨lnc-9163对卵巢颗粒细胞CryBB2的调控作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 100只C57/B6小鼠购自中国科学院上海实验动物中心[SCXK(沪)2017-0002]，饲养于海军军医大学实验动物中心[SCXK(军)2002-011]SPF级(无特定病原体动物级)动物房。

1.2 样品准备 根据小鼠的年龄将其分为5组：刚出生、出生后1周、2周、1个月及3个月，每组至少4只，腹腔注射孕马血清促性腺激素(PMSG，HOR-272，PROSPEC)10 U，腹腔内留存48 h。麻醉后颈椎脱臼处死，取其卵巢组织即刻进行后续实验。

1.3 小鼠卵巢颗粒细胞分离与培养 常规消毒，取双侧卵巢放入无菌磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)中，去除卵巢周围组织及表面包膜，PBS清洗后置于DMEM/F12培养液[含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、10 ng/mL表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)、100 U/mL双抗]中。在光镜显微镜下用25号针头刺破卵巢表面的卵泡，使颗粒细胞释放于培养液中。300 ×g离心5 min，洗涤2次，弃上清。取DMEM/F12生长培养液2 mL加入沉淀在离心管底的细胞团中，并制成单细胞悬液。将收集到的小鼠卵巢颗粒细胞悬液接种于含15% FBS的DMEM/F12培养液的6 cm培养皿中，每2个卵巢细胞1个皿，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h。24 h后弃培养液，用新鲜培养液洗1次，用0.25% Tryspin-EDTA胰酶消化细胞，同等体积含血清培养液终止消化，收集所有培养皿内的细胞液，300 ×g离心5 min，弃上清，制成单细胞悬液。调整细胞数量至1×106～1×107个/mL，将细胞接种于24孔板或6孔板中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h。

1.4 体内过表达 lnc-9163 AAV构建及小鼠尾静脉注射 lnc-9163片段、AAVrh10载体均购自维真生物公司，AAVrh10载体过表达lnc-9163及对照病毒构建、包装均由上海和元生物有限公司完成。-80°C保存病毒。用无菌PBS稀释病毒，按照5×109滴度/只经尾静脉注射入小鼠体内，3周后开始分选颗粒细胞(图1)。

图1 过表达lnc-9163小鼠模型的构建及验证

1.5 过表达和干扰lnc-9163人卵巢颗粒细胞株KGN构建 慢病毒载体pLenR、lnc-9163干扰序列购自中乔新州公司，慢病毒核心元件质粒构建也由该公司完成，KGN、293T细胞由海军军医大学细胞生物教研室馈赠。按照流程制备好过表达和干扰lnc-9163病毒以及对照病毒，将病毒加入KGN细胞中，培养7 d后根据载体上的真核抗性筛选细胞。

1.6 反转录及实时定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)检测mRNA表达水平 采用TRIzol试剂提取小鼠卵巢组织总RNA，采用反转录试剂盒(TaKaRa公司)反转录获得cDNA，以此cDNA为模板进行qRT-PCR。采用荧光定量PCR仪(Rchoe公司)，试剂盒为SYBR-Green PCR Kit(TaKaRa公司)。反应条件：95℃ 2 min，95℃ 15 s、60℃ 30 s循环40次。采用GADPH为内参照，采用2-ΔΔCt法分析数据。引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.7 Western印迹法检测蛋白表达水平 提取小鼠卵巢组织总蛋白，采用BCA法定量蛋白浓度，调整为2.5 g/L，按比例加入十二烷基硫酸钠上样缓冲液(5×)，105 ℃加热10 min变性，每孔上样20 μL进行SDS-PAGE电泳，转膜，封闭，加入兔抗lnc-9163多克隆抗体(Abcam公司，ab121884，稀释比例1∶500)，4 ℃孵育过夜，加入1∶10 000稀释的二抗(辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊多克隆抗体， KPL公司)室温孵育1 h，TBST洗涤3次，ECL发光液处理后暗室内曝光胶片。实验重复3次。检测卵巢颗粒细胞增殖相关蛋白细胞周期相关蛋白D1(cyclin D1,1∶1 000, ab16663, Abcam公司)，增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA, 1∶1 000, ab92552, Abcam公司)、凋亡相关蛋白半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)切割体(1∶1 000, ab13847, Abcam公司)、多聚ADP核糖聚合酶1(poly ADP-ribose polymerase 1, PARP1)切割体(1∶1 000, ab32064, Abcam公司)。

1.8 5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(5-ethynyl-2’-deoxyuridine,EdU)细胞增殖检测 将各组的颗粒细胞按照1×104密度接种于小皿中培养备用。按照1∶1 000用培养液稀释EdU细胞增殖检测试剂盒(C10310-1，广州锐博生物有限公司)中EdU试剂，在-20 ℃保存，每个小皿加入100 μL稀释的EdU试剂，孵育2 h，用甲醇-丙酮液固定细胞10 min，PBS清洗3～4次，每次5 min。加入500 μL 2 g/L甘氨酸，孵育5 min，PBS清洗2次，每次5 min。加入1 000 μL含0.5% Triton X-100的PBS，孵育10 min，PBS清洗2次，每次5 min。按照试剂盒说明书配制Apollo显色液，加入500 μL，避光孵育30 min，PBS清洗2次，每次5 min；加入用PBS稀释的DAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚,4’,6-diamidino-2-phenylindole)染色液(1∶1 000稀释)孵育1 min，PBS清洗1次，避光保存。显微镜下观察荧光染色情况。

1.9 Annexin Ⅴ-PI双染细胞凋亡检测 Annexin V-PI试剂盒购自Thermo公司(V13242)。将待检测细胞弃去培养液，PBS冲洗3次，加入不含EDTA的胰蛋白酶消化约5 min，轻柔吹打至细胞完全脱离培养皿，转移至EP管中，900 ×g离心3 min，弃上清，加入PBS清洗3次，每次清洗后2 000 ×g离心3 min。加入500 μL结合缓冲液，轻柔吹打，充分混匀；加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC吹打混匀，静置1 min；加入5 μL PI，吹打混匀后，于室温、避光条件下反应15 min。流式细胞仪上检测各通道染色细胞所占百分比。

1.10 TUNEL法检测细胞凋亡 TUNEL凋亡试剂购自锐博生物有限公司(C11012-1)。将各组颗粒细胞按照1×104密度种植于小皿中培养备用。用甲醇-丙酮溶液(1∶1体积混合)固定细胞10 min，加入1 000 μL含0.5% Triton X-100的PBS，孵育10 min，加入可以覆盖培养皿底部的末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT酶)缓冲液，室温下反应5 min；加入100 μL TdT酶，37 ℃孵育1 h。然后加入适量37 ℃预热的洗涤液于37 ℃孵育30 min，PBS洗涤3次，每次5 min。按照说明书配制TUNEL反应混合液，加入100 μL，室温下反应30 min，用柠檬酸钠缓冲溶液(SSC，20倍去离子水按1∶10稀释)终止反应(室温放置10 min)。PBS洗涤3次，每次5 min，用PBS稀释的DAPI染色液(1∶1 000稀释)孵育1 min，PBS清洗1次，避光保存，观察荧光染色情况。

2 结 果

2.1 不同周龄小鼠卵巢颗粒细胞中lnc-9163的表达 结果(图2)显示：随着小鼠周龄增长，lnc-9163表达逐渐升高(P<0.05)，提示lnc-9163可能参与小鼠卵巢发育过程。

图2 不同周龄小鼠卵巢颗粒细胞中lnc-9163的表达

2.2 lnc-9163过表达后小鼠颗粒细胞内CryBB2表达 通过尾静脉注射腺病毒方式获得过表达lnc-9163的卵巢组织，分选出颗粒细胞后，qRT-PCR(图3A)显示卵巢组织颗粒细胞中lnc-9163表达增加，提示构建过表达小鼠成功。对收集的颗粒细胞采用qRT-PCR(图3B)和Western 印迹法(图3C)检测CryBB2蛋白表达，结果均显示过表达组CryBB2表达水平较对照组提高了约4倍(P<0.01)。

图3 卵巢颗粒细胞过表达后及CryBB2检测

2.3 KGN过表达及干扰lnc-9163后检测CryBB2表达 qRT-PCR(图4A)显示过表达lnc-9163的稳定KGN构建成功。qRT-PCR(图4B)和Western 印迹(图4C)均显示，lnc-9163过表达组的CryBB2表达水平较对照组提高了近3倍(P<0.05)。针对lnc-9163片段中3段位点，利用GeneMed软件设计3对干扰引物序列，并通过pLenR构建3种序列，筛选出成功干扰的序列及相应细胞。结果(图5A～5C)显示，干扰lnc-9163后CryBB2 mRNA和蛋白表达下调，与对照组差异均有统计学意义(P<0.01)。

图4 过表达lnc-9163人卵巢颗粒细胞系KGN建立及CryBB2表达检测

图5 干扰lnc-9163的KGN建立及CryBB2表达检测

2.4 lnc-9163促进颗粒细胞增殖 过表达lnc-9163的KGN细胞中EdU标记的阳性细胞在每个20倍视野下约191个，而对照组仅112个，差异有统计学意义(P<0.01，图6A、6B)。Western检测(图6C)显示，细胞增殖相关蛋白细胞周期相关蛋白D1及增殖细胞核抗原在过表达lnc-9163的KGN细胞中表达增加(P<0.01)，在干扰lnc-9163的KGN细胞中表达减少(P<0.01)。

图6 lnc-9163促进颗粒细胞增殖

2.5 lnc-9163促进颗粒细胞凋亡 TUNEL检测结果(图7A、7B)显示，过表达lnc-9163的颗粒细胞凋亡增多，与对照组差异有统计学意义(P<0.01)。Western印迹法检测(图7C)显示，caspase-3切割体及PARP1切割体在过表达lnc-9163的颗粒细胞中表达均增加(P<0.05)，在干扰lnc-9163的颗粒细胞中表达均减少(P<0.05)。流式细胞术检测结果(图7D)显示，细胞中AnnexinⅤ-PI标记的凋亡细胞所占比例与Western印迹法检测结果一致。

图7 lnc-9163促进颗粒细胞凋亡

3 讨 论

本研究通过设计lnc-9163过表达以及干扰序列，从体内和体外不同模型，分别构建了过表达和干扰lnc-9163颗粒细胞。过表达和干扰lnc-9163颗粒细胞中CryBB2表达水平也发生改变，且两者存在正向调节关系。同时，lnc-9163可能促进细胞增殖和凋亡。结合前期研究[6]结果，即CryBB2全敲小鼠的睾丸生殖细胞增殖和凋亡增多，lnc-9163可能在颗粒细胞内参与调控CryBB2分子介导的细胞增殖和凋亡过程。

自从在晶状体外组织发现CryBB2的表达以来，多项研究[9-11]报道了CryBB2在不同组织中的不同作用。CryBB2可能参与卵巢颗粒细胞的发育过程，但对其调控机制仍然未知。前期研究[8]认为，lnc-9163可通过P2rx7-Ca2+通道- CryBB2轴来调控CryBB2基因表达。因此，本研究探究lnc-9163生物学功能及与CryBB2表达的关系。本研究结果发现，随着小鼠卵巢周龄增加，lnc-9163在颗粒细胞中表达增加，这提示lnc-9163可能参与了卵巢发育过程。过表达或者干扰lnc-9163后的颗粒细胞内CryBB2蛋白表达同向改变，也提示lnc-9163与CryBB2可能存在轴向调控机制。结合CryBB2在体内生殖细胞表达的时相，推测lnc-9163可以调控CryBB2基因的表达，但是具体调控机制仍待后续深入研究。

越来越多的研究关注lncRNA在卵巢颗粒细胞中的作用，例如Xiong等[12]报道了lncRNA-Meg3-p53-p66Shc轴可以影响卵巢颗粒细胞增殖；Kimura等[13]报道了lncRNA-Amhr2可以通过影响抗苗勒管激素(AMH)的分泌来影响卵巢颗粒细胞功能。LncRNA与卵巢功能密切相关，本研究也提示lnc-9163与卵巢颗粒细胞的增殖和凋亡密切相关，过表达lnc-9163可以促进颗粒细胞增殖和凋亡发生。凋亡和增殖的发生并不是相反的，也有可能是同向改变，取决于基因对凋亡或增殖相关基因的直接作用及所处的组织环境。Dedera等[14]报道，E2A-PBX1可以在淋巴结中同时促进增殖和凋亡；Sakao等[15]认为在血管密集的区域存在凋亡后增殖加快的现象，这是机体的一种自我保护，为了维持整体细胞数目的平衡。由此推测lnc-9163可能通过影响CryBB2来促进凋亡发生，而加快的细胞增殖由颗粒细胞较强的增殖能力有关或为凋亡后代偿性增殖。然而，相关结论仍需要进一步研究来证实。

综上所述，本研究首次发现lnc-9163在卵巢颗粒细胞发育中逐渐升高，参与调控CryBB2蛋白表达，促进颗粒细胞增殖，与凋亡发生密切相关。本研究为探索CryBB2分子体内调控机制以及女性不孕不育分子机制提供研究思路。

利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。