Th22细胞及IL-22、IL-9因子在肺癌患者外周血中的表达 ①

王 晶,曲修胜,马雪梅,李树民,杨晓东,李 娜

(佳木斯大学附属第一医院呼吸内科，黑龙江 佳木斯 154003)

原发性支气管肺癌简称肺癌，是我国病死率最高的恶性肿瘤之一，严重危害人类健康，依据GLOBOCAN估算，2012 年全球患有癌症人数可达1410 万人，因其死亡人数达820 万，其中肺癌是最常见的肿瘤之一[1]，因此更早的期诊断、治疗肺癌有着非常重要的意义。近年来，有学者发现Th22 细胞是一种的新型、独立的 CD4+辅助性T细胞亚群，IL-22是其分泌的重要细胞因子，在肿瘤疾病中，已经有研究表明Th22细胞及其分泌的IL-22因子在肝癌、胃癌等均有表达[2]，在胰腺癌中，IL-22也可以通过STAT3通路加强胰腺癌细胞生长[3]。而IL-9是于2008年被研究发现主要由Th9分泌的拥有促炎作用的CD4细胞亚群，通过激活STAT3磷酸化也能促进人胰腺癌生长[4]，因此二者可能在肿瘤疾病中存在某种联系，但对于Th22、IL-22与IL-9在肺癌中的关系鲜有报道，因此本研究拟探讨Th22细胞、IL-22与IL-9在肺癌发病中的表达情况及相关性分析。

1 资料与方法

1.1 一般资料

肺癌组选取2018-11～2019-05在我院确诊的肺癌患者35例作为实验组；年龄42～78岁，平均65岁，男21例，女14例，所有病例均经病理组织学检测确定为肺癌，健康对照组35 例，为同期于我院体检的健康者，其中男25例，女10例，年龄40～82岁，平均70岁。纳入标准：1)年龄>18岁；2)已确诊并明确病理及组织分型的原发性肺癌患者；3)既往未接受过放化疗治疗，并且未应用免疫抑制剂治疗的患者。实验排除标准：1)有肺结核、肺部急性感染等其他肺部疾病的肺癌患者；2)有严重心、肝、肾功能有异常的患者；3)有其他恶性肿瘤史的癌症患者；所收集的实验组35例患者研究资料收集经研究对象知情同意，遵守伦理学的各项规定。

1.2 实验方法1.2.1 主要仪器及试剂

美国BD公司流式细胞仪、芬兰(Labsystems Multiskan MS)公司352型酶标仪、中国海尔4℃和-20℃冰箱，-80℃超低温冰箱，北京索莱宝科技有限公司人外周淋巴细胞分离液、BD PharMingen、anti-CD4-APC试剂、Biolegend、anti-IL-22-PE，及相应同型对照抗体，莫能霉素及破膜剂均来自美国BD公司，ELISA 检测试剂盒(上海信帆生物科技有限公司)。

1.2.2 方法

1.2.2.1 血液标本的采集: 用肝素抗凝采血管采集入组病人的静脉血4mL,用非抗凝普通采血管采集静脉血1mL, 冰盒保存并于1h内转移至实验中心待用，待血液凝固后，将1mL全血2500rpm 4℃离心10min，取上清液分装于 EP 管中，每管 50μL，保存于-80℃低温冰箱。

1.2.2.2 Th22细胞的检测: 将经过肝素钠作抗凝处理的新鲜采集的外周4mL全血标本取出，混匀，加入PBS液8mL,进行稀释；小心提取外周血单个核细胞后，将上述液体孵育4h后取出孵育板，使用移液器将收集培养箱中细胞，尽量全部吸出，分别转移到2个流式管中，标记为对照管和检测管，加入PBS吹打混匀，1200rpm×5min洗涤1遍后弃上清；分别吸取荧光标记的表面抗体，anti-CD4-APC-H7加入检测管中，对照管中加入相应同型对照抗体，充分混匀，静置30min；2mL PBS洗涤一次，200μL的4%多聚甲醛重悬，室温静置20min后，两管中分别加入1mL破膜剂，震荡混匀，避光孵育后，分别再向两管中加PBS 5mL,离心5min弃上清，RPMI1640重悬；向检测管加入细胞内细胞因子抗体 anti-IL-22-PE；并向对照管中加入同型对照抗体，充分混匀后，4℃条件下避光孵育30min；PBS5mL洗涤后重悬，将重悬后的细胞液体采用 BD FACSCantoⅡ流式细胞仪上机检测 ，结果以CD4+IL-22+T细胞在CD4+T细胞中所占百分比进行统计。

1.2.2.3 IL-22、IL-9的检测： 将待测标本及ELISA试剂盒预先从冰箱拿出，并拆除密封袋，核对好所需实验试剂，严格按照酶联免疫吸附试验(ELISA) 试剂盒操作步骤检测血清中IL-22、IL-9 表达水平，测出OD值绘制标准曲线，计算样品浓度。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 Th22细胞的表达水平

肺癌患者与健康对照组外周血中，Th22细胞(CD4+IL-22+T)、IL-22、IL-9因子的表达水平见表1；可以看出，实验组Th22、IL-22的表达水平明显高于对照组(P<0.01)，差异有显著性；实验组IL-9表达水平高于对照组(P<0.05)，差异有显著性。见图1～2。

表1 肺癌患者与健康人群Th22细胞、IL-22、IL-9因子的表达水平

图1 肺癌组与对照组Th22表达水平

图2 肺癌组与对照组IL-22、IL-9的表达水平

2.2 相关性分析

肺癌患者中，Th22、IL-9与IL-22表达相关性分析见图3～4； 经Pearson相关性分析发现，肺癌实验组患者外周血中，Th22、IL-22呈正相关(r=0.605，P<0.01),IL-22与IL-9呈正相关(r=0.58,P<0.05)。

图3 Th22与IL-22相关性分析

图4 IL-22与IL-9相关性分析

3 讨论

肺癌是世界范围内因肿瘤疾病死亡主要原因之一，临床上在治疗无效的原因多是转移和耐药，较早的发现肿瘤，是治疗肿瘤疾病重要的一个环节[5]。体液免疫和细胞免疫组成了机体的免疫系统，而细胞免疫在抗肿瘤中发挥重要作用，在细胞免疫中起主要作用的效应细胞是 CD4+T淋巴细胞[6]。 Duhen T等人在2009年发现Th22细胞是一种新型 Th 细胞， 并提出高分泌IL-22细胞因子，因此对于二者的研究越来越多[7]，Th22细胞及效应因子IL-22因子存在很多疾病中，在炎症性疾病中，如系统性红斑狼疮中、系统性硬化症、白塞病中，二者均高表达[8]，另外还参与了表皮免疫和修复，在肿瘤系统疾病中， Curd[9]等实验提出，IL-22在人胰腺癌中能够引起STAT-3磷酸化，这表示IL-22在人胰腺癌细胞中促进肿瘤生长。在乳腺癌中， 实验组Th22细胞、IL-22因子表达高于对照组[10]。IL-9是机体重要免疫因子之一，有研究证实，其能够参与恶性肿瘤疾病的发生，在肝癌患者中，IL-9能够使肝癌细胞增殖，并且在肝癌腹水中表达增强[11]，在胰腺癌裸鼠移植瘤研究中，IL-9能够通过激活 STAT3磷酸化促进其生长，并且缩短裸鼠的生存寿命[12]。但对于Th22、IL-22与IL-9在肺癌患者外周血的表达及相关性鲜有报道。

本研究结果提示，肺癌患者外周血中，Th22细胞与IL-22因子表达较健康对照组升高，由图3也可以看出二者呈正相关，更加说明IL-22由Th22分泌，Th22通过介导分泌IL-22参与肺肿瘤的发生发展。IL-9在实验组中的表达明显高于健康对照组，IL-22因子与IL-9二者呈正相关，可能与二者促进STAT-3通路加快肺肿瘤的生长有关，这表明Th22细胞、IL-22因子与IL-9在肺肿瘤的发生发展中起着重要作用，可能促进人类肺肿瘤疾病的发生、发展，具体机制可能与其能够促进STAT3磷酸化有关，STAT3是双功能蛋白，主要是能通过酪氨酸磷酸化通路发挥作用，在人肿瘤疾病中表达升高[13]。 在肺肿瘤疾病中的作用，需要进一步研究。可以通过调节Th22 细胞及IL-22、IL-9因子表达，从而调节机体免疫状态，为肺肿瘤疾病的防治策略提供依据。