正交实验优化油茶粕中糖萜素提取工艺

袁成华，杨琼玲，邓爱华 ，李菊元，何婉琳

（1.湖南省康多利油脂有限公司，湖南 常德 415700；2.湖南文理学院 生命与环境科学学院，湖南 常德 415000）

我国油茶资源丰富，油茶籽炸油后剩余的油茶粕中富含有大量的糖萜素。糖萜素是一类由茶皂素( ≥30% ) 、多糖( ≥30% ) 及蛋白等组成的天然活性物质，主要用于饲料添加剂，替代抗生素在饲料中的应用，其具有化学成分稳定、无抗性干扰、无药残、无抗药性及无任何配伍禁忌，可配制成预混合饲料[1-2]。在动物饲料中添加糖萜素后，动物机体的免疫力得到大大增强，抗生素的用量大大减少[3]。目前，糖萜素的主要提取方法有溶剂直接提取法、转化合成法和生物酶法等。水提法较为经济，但水溶性杂质较多，糖萜素收率较低；甲醇提取法比水提法收率提高了80%，但甲醇易挥发且有一定的毒性，对于操作工人身体有一定的损害[4-5]；转化合成法需先将茶皂素和茶多糖分开提取，再按照比例进行合成转化，制备的糖萜素纯度较高，但工艺复杂，收率偏低[6]；微生物发酵法发酵时间长，发酵设备投资大[7-8]。本实验拟先通过超临界二氧化碳代替石油醚除脂，其脱脂效率高，能进一步提高糖萜素的溶出率，所用乙醇溶剂安全且可以回收循环利用。通过单因素实验和正交实验设计优化糖萜素提取工艺参数，并对所制备的糖萜素中总皂苷、总糖含量、总蛋白等关键指标进行检测分析，以期为油茶废弃物中糖萜素的综合开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

油茶粕：湖南省康多利油脂有限公司；3,5-二硝基水杨酸（分析纯）、茶皂素（分析纯）、牛血清蛋白（分析纯）、考马斯亮蓝（分析纯）、高氯酸（分析纯）、香草醛（分析纯）、乙醇（分析纯）：国药化学试剂有限公司；氢氧化钠（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

JB/T5374型电子天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；UV-1600型分光光度计：翱艺仪器有限公司；ZWL-LS1-10型超纯水机：湖南中沃水务环保科技有限公司；DZF型真空干燥箱：邦西仪器科技有限公司；HH-6JS型磁力搅拌水浴锅：常州朗越仪器制造有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 糖萜素制备工艺

油茶粕→粉碎→超临界流体脱脂→乙醇浸提→过滤→真空浓缩→浓缩物正丁醇萃取→萃取相真空浓缩→浓缩物真空干燥→糖萜素成品

1.3.2 糖萜素含量及质量指标测定方法

糖萜素含量及质量测定方法参考国家标准[9-10]的方法。茶多糖测定：采用3,5-二硝基水杨酸法；总皂苷测定：高氯酸-香草醛法；蛋白质测定：考马斯亮蓝法；糖萜素提取率按式（1）计算。

1.3.3 单因素实验设计

准确称取5份经脱脂的油茶粕20 g，按照液固比20:1（mL/g）加入75%的乙醇水溶液，在80 ℃下浸提3 h，浸提1次，浸提液按照1.3.1所述步骤提取糖萜素，根据标准曲线方程计算糖萜素的提取率。单因素实验分别考察乙醇浓度（55%、65%、75%、85%、95%），浸 提 温 度（50、60、70、80、90 ℃），液固比（10:1、15:1、20:1、25:1、30:1（mL/g）），浸提时间（1、2、3、4、5 h）浸提次数（1、2、3、4、5）等对糖萜素提取率的影响规律；当考察某一因素时，其他因素按上述条件不变。

1.3.4 正交实验设计

根据单因素实验结果，选定适宜的甲醇浓度、浸提液固比、浸提时间、浸提温度和浸提次数等5个因素的水平，运用 L16( 45) 正交表确定最佳工艺条件，实验因素水平及编码见表 1。

表1 正交实验因素水平

2 结果与分析

2.1 标准曲线方程

2.1.1 多糖标准曲线方程

如图1所示，以葡糖糖浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制多糖标准曲线，通过拟合得到多糖标准曲线方程为Y= 1.063 8X+ 0.027 7，R2= 0.991 8，说明所选取的线性范围好。

2.1.2 茶皂素标准曲线方程

如图2所示，以茶皂素浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制茶皂素标准曲线，通过拟合得到多糖标准曲线方程为Y= 0.539 6X+ 0.099 9，R2= 0.999 1，说明所选取的线性范围好。

2.1.3 蛋白质标准曲线

如图3所示，以牛血清蛋白浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制牛血清蛋白标准曲线，通过拟合得到多糖标准曲线方程为Y= 0.049 5X+ 0.029 4，R2= 0.997 4，说明所选取的线性范围好。

2.2 单因素实验

2.2.1 乙醇浓度对提取率的影响

如图4所示，随着乙醇浓度的增加，糖萜素收率逐渐增大，当乙醇浓度达到75%时，糖萜素收率达到最大26.5%；当进一步提高溶剂中乙醇浓度，糖萜素的收率呈现下降趋势。可能是提高乙醇浓度，溶剂的极性降低，物料中茶皂素或茶多糖等溶出度降低，导致糖萜素的整体比例下降，选择合适的乙醇浓度在65%～85%。

2.2.2 温度对提取率的影响

如图5所示，当温度较低时，物料中糖萜素在浸提液中的溶解性较差，分子运动较慢，不利于物质的传质。前期随着温度的上升，溶解度不断增加，糖萜素提取率增加较快，在75 ℃左右提取率达到最大26.7%。此时物料中的糖萜素传质速率已经达到最大，当温度进一步升高时，影响不明显；80 ℃以上，乙醇的挥发性增加，降低了提取液的量，高温也会加速物料中的蛋白质和果胶等杂质变性沉淀。综合能耗成本和设备成本，选择提取温度在65～85 ℃较为适宜。

2.2.3 液固比对提取率的影响

如图6所示，随着乙醇体积的增加，糖萜素提取率增加；当比例达到20:1（mL/g）时，糖萜素提取率达到26.3%，后续增加溶剂的比例，对提取率影响不大，说明糖萜素基本提取出来。溶剂用量太大，一方面增加溶剂的消耗量，另一方面增加后续浓缩成本；同时，提取的糖萜素中蛋白类等其他杂质含量偏高，增加纯化成本和降低产品品质。合适的提取液固比控制在15:1～25:1（mL/g）较为合适。

2.2.4 时间对提取率的影响

如图7所示，随提取时间的增加，糖萜素收率不断增加，当达到3.0 h后，继续增加提取时间，糖萜素收率增长幅度较小，表明物料中的糖萜素已基本溶出，糖萜素的传质过程基本达到平衡。从生产周期和设备能耗综合考虑，适宜的提取时间为2.5～3.5 h。

2.2.5 提取次数对提取率的影响

如图8所示，糖萜素提取率与提取次数呈正相关，前2次提取率增加幅度较大，后续增长幅度较小。提取次数越多，溶液中水溶性杂质的比例会明显增多，导致后续糖萜素的纯度下降；同时，提取次数的增加也会导致浓缩成本和分离成本增加，选择提取次数在2～3次较为适宜。

2.3 正交实验

通过拟水平补充法设计L16( 45) 正交实验如表2所示。由表2可知，各因素对糖萜素提取量的的影响大小依次为：E（提取次数）＞ A（乙醇浓度）＞ D（时间）＞ C（液固比）＞ B（温度），在选取的因素考察范围内，提取次数的影响最显著，其次是乙醇的浓度，提取的液固比和温度影响比较小。根据优化分析，较合适的提取工艺参数为E2A3D2C1B2，该工艺下提取工艺所需溶剂消耗量小和能耗低。

正交实验优化得到油茶粕中糖萜素提取的最佳工艺参数为E2A3D2C1B2，即在乙醇浓度80%、温度75 ℃、液固比15:1（mL/g）下提取3 h，提取2次，最佳组合不在本正交实验设计中，按此条件组合提取糖萜素的收率为33.47%，与正交实验的最高得率33.21%接近。

2.4 糖萜素质量分析

根据GB/T 25247—2010《饲料添加剂 糖萜素》的关键质量指标为总皂苷≥30%，配糖体≥30%，粗蛋白量≥7%，干燥失重≤7.0%。本实验提取的糖萜素呈浅棕黄色，根据标准曲线方程计算糖萜素中总皂苷含量为32.2%，总糖含量为34.7%，干燥失重率为5.7%，蛋白含量为12.3%，均满足国标中糖萜素的质量指标。

3 结 论

本实验通过单因素实验探讨各因素对茶籽粕中糖萜素提取率的影响规律，并通过正交实验设计优化得到最佳提取工艺参数乙醇浓度80%、温度75 ℃、液固比15:1（mL/g）、时间3 h、提取2次，糖萜素的收率为33.47%；经检测分析所制备的糖萜素各项关键技术指标符合国家标准要求。本实验可为我国茶油产业副产物的综合开发利用提供参考。