BDNF转染干细胞治疗周围神经损伤的研究进展

关茗岩，刘建宇

(哈尔滨医科大学附属第二医院骨外科，哈尔滨 150081)

周围神经损伤(peripheral nerve injury，PNI)的影响人群较广泛，其中发展中国家患者的占比较高，且人数逐渐增多[1-3]，除可直接导致与伤害相关的功能和心理后果外，PNI还与全球社会经济和成本相关[4]。PNI的原因主要包括事故、穿透伤、摔伤、缺血、感染、骨折后邻近神经损伤、医源性损伤等[5]。

目前PNI的治疗方法多样，如在外科手术中行神经外膜缝合，但术后神经功能恢复情况受到炎症、感染、手术缝线、瘢痕等的影响，修复效果不能令人满意[6]；自体不带血管神经移植对于成段的神经缺损效果最好，但可导致供体神经功能缺失，故来源有限、无法满足临床需求；此外，中医中药起效慢，长期服用具有肝、肾毒性，缺少更多循证医学证据。为了解决上述难题，依据不同类型干细胞的特征研究PNI与修复的机制发现，神经营养因子在PNI与其修复机制中发挥重要作用，特别是脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)[7]。现就BDNF转染干细胞治疗PNI的研究进展予以综述。

1 PNI及修复机制

PNI后导致损伤平面轴突和髓鞘破坏，神经支配的靶器官与轴突之间发生断裂，轴浆运输中断，受损神经短时间内自近端向远端发生变性，神经元细胞形态发生改变，这一系列反应称为沃勒变性(Wallerian degeneration)，可导致运动终板乙酰胆碱酯酶活性下降。沃勒变性会引起血液-神经屏障通透化[8]，并通过对组织损伤敏感的受体激活附近的施万细胞和巨噬细胞，施万细胞通过脱落髓鞘、增殖、吞噬碎屑、释放募集血液中的单核细胞/巨噬细胞的细胞因子对损伤做出反应[9]。随后，施万细胞沿神经内膜鞘增生，通过与多种细胞外基质相互作用稳定髓鞘的正常状态，并可分泌细胞因子(血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、BDNF等)，其中BDNF可调节神经元发育和功能的几乎所有方面，包括诱导、增殖及分化[7]，升高的BDNF水平通过促分裂原活化的蛋白激酶信号转导通路修复退化的神经元、增强神经元活动、促进轴突生长[10]。此外，施万细胞还通过Ca2+/钙调神经磷酸酶、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白等信号通路参与PNI的早期修复[11-12]。

2 BDNF的应用研究

神经营养蛋白首次由Brade等[13]通过纯化猪脑发现，该蛋白质具有营养作用，可促进神经元发育，且分布广泛，对于调节神经增殖、分化、成熟和可塑性等过程至关重要，可影响细胞的生命和死亡途径之间的转换，其中BDNF在大脑特别是海马组织中呈高表达，几乎可调节神经元发育和功能的所有方面[14-15]。

在中枢神经系统中，BDNF在脑认知功能(如记忆、学习、行为和情绪控制)中起重要作用[16]，BDNF还可通过Ras-促分裂原活化的蛋白激酶、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B以及磷脂酶Cγ、Ca2+等[7]信号转导通路发挥多种不可或缺的作用，如保护神经细胞、促进神经元的存活和发育繁殖、防止神经元受损死亡，维持海马内突触可塑性和促进突触再生，同时上述信号转导通路还影响患者认知功能，而认知功能是获取和巩固记忆的基础，表明BDNF高水平表达与言语记忆和识别能力相关，并可能抵消慢性压力和认知能力下降的影响。此外，BDNF还作用于阿尔茨海默病中耗竭的胆碱能神经元[17]、帕金森病中丢失的黑质多巴胺能神经元[18]，而高水平BDNF产生的抗抑郁药能够产生更好的神经塑性结果[19]，起到延缓疾病进展的作用。因此，老年人BDNF水平降低可能导致记忆力减退、神经退行性变以及其他认知障碍[20]。

在周围神经系统中，微RNA-1与BDNF的3′非翻译区靶向位点结合，抑制BDNF信使RNA的降解和翻译，培养的施万细胞中微RNA-1的过表达或沉默分别抑制或增强了细胞的BDNF分泌，并分别抑制或促进施万细胞的增殖和迁移[21]。BDNF通过结合轴突上原肌球蛋白受体激酶B受体增强神经突伸长，若BDNF再生轴突的可用性减弱，则轴突再生将受到严重损害[22]。Fornaro等[23]使用两个背根神经节外植体和背根神经节衍生的原代细胞制作分离培养物的体外模型，研究BDNF对神经突生长的影响，定量数据表明，BDNF可刺激感觉纤维的曲折生长和细胞簇的形成，促使轴突向周围靶标分布，上述发现对于BDNF在周围神经再生中的临床应用具有重要意义。Scheper等[24]在人骨髓中分离人间充质干细胞，通过转导和基因表达分析将人间充质干细胞分化为过量表达BDNF的软骨细胞，从而增加体外神经元的存活率，证实BDNF过表达后人间充质干细胞可进一步对神经产生保护作用。综上所述，BDNF在中枢及外周神经均可直接、间接(转染、诱导等)促进轴突再生，是修复损伤神经的重要元素。

3 BDNF转染干细胞后的治疗

干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞，根据所处发育阶段不同可分为胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)和成体干细胞。从胚胎分离的干细胞称为ESCs，从成人分离的干细胞称为成体干细胞[25]。根据干细胞发育能力的不同又可分为全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)是经细胞核重新编程为胚胎样多能状态的成体细胞，可通过将体细胞核转移到卵母细胞中[26]，或通过多能转录因子[27]诱导。

3.1ESCs ESCs来源于发育中的胚泡的内部细胞团，通过体外或体内形成胚状体来评估，其可在体外维持较长的时间，且不会失去自我更新或发育潜能，产生代表内胚层、中胚层和外胚层的细胞类型，用于PNI修复的治疗。Cui等[28]证实，经ESCs诱导施万细胞移植入大鼠坐骨神经后会出现大量的轴突再生和神经修复。另有研究表明，基因修饰后的人ESCs过表达成纤维细胞生长因子-2，有助于强化脊髓损伤后神经元的保护作用，并促进BDNF等神经营养因子的分泌，表明ESCs可能通过过表达BDNF保护运动神经元，保持突触覆盖并降低星形胶质细胞反应性[29]。有实验证明，BDNF和绿色荧光蛋白转染后的ESCs可使神经元数量增加，且适用于各种神经病理学条件下BDNF细胞移植改善作用的研究[30]。但是，ESCs源自体外受精的人类胚胎，存在伦理问题，具有致畸胎瘤的潜在风险。目前已成功通过电穿孔法使ESCs过表达BDNF[31]，但后续对周围神经的修复暂无相关报道。

3.2成体干细胞

3.2.1骨髓来源干细胞 间充质干细胞是中胚层来源的成体干细胞，具有高度的自我更新、多向分化潜能，且来源丰富，可从骨髓、脂肪组织、脐带、羊水、肌腱、胚胎绒毛膜、乳牙和胎儿的肝脏等组织分离出来。

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是具有可塑性的多能干细胞，可被诱导分化为多种细胞谱系，包括成骨细胞、软骨细胞、肝细胞、神经细胞等，易于分离，移植排斥率低。实验表明，用慢病毒转染BDNF的BMSCs可在体外分化为神经样细胞，这与原肌球蛋白受体激酶B受体结合的表达有关，促进未分化人间充质干细胞发育为成熟神经元，以治疗神经元疾病[32-33]。Li等[34]通过腺病毒方法转染BMSCs并联合促红细胞生成素促进轴突生长，修复脊髓损伤后大鼠神经，改善其后肢运动功能。同理，采用腺病毒方法使BMSCs过表达BDNF，并在功能化的自组装肽水凝胶中诱导神经元样细胞治疗脊髓损伤后神经修复的效果较好[35]。将过表达BDNF和神经胶质细胞系神经营养因子的BMSCs作为种子细胞引入高度定向的聚(L-乳酸)/大豆分离蛋白纳米纤维神经导管的方法，大幅度提高了神经修复的效率[36]。

3.2.2脂肪来源干细胞 近年来，脂肪组织已能够作为分化为中胚层细胞谱系的基质细胞的替代来源，脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是具有类似于BMSCs的表型和基因表达谱的多能干细胞，具有神经营养特性，能够分化为多种细胞谱系。国内研究已实现BDNF过表达慢病毒载体，并建立了稳定表达的ADSCs株[37]。也有研究表明，ADSCs和施万细胞共培养后，ADSCs表现出典型的纺锤形S-100标记细胞——施万细胞的特征，使用慢病毒转染方法使ADSCs过表达BDNF，并通过对鼠损伤的坐骨神经的电生理、步态分析获得坐骨神经恢复指数等证明ADSCs具有促进神经髓鞘再生、改善运动和神经的功能[38]。Schweizer等[39]将ADSCs移植到啮齿动物坐骨神经损伤模型中，证实ADSCs对神经再生有良好的影响，另外，BDNF联合神经营养蛋白-3通过慢病毒法共转染大鼠ADSCs后可成功向施万细胞方向诱导，对维持神经元存活和促进神经元分化有促进作用,也验证了双因子比单一营养因子更具有优越性，为组织工程技术治疗脊髓损伤的未来实验提供了坚实的理论基础[40]。

3.2.3脐带来源干细胞 脐带是在母体和胎儿之间运输营养物质的枢纽，含有大量的间充质干细胞即人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs)，胎儿出生后的脐带来源丰富，不会出现伦理问题，具有促血管生成、抗炎、神经修复、免疫调节功能及非致瘤性[41-44]。hUCMSCs可通过分泌各种神经营养因子并沉积细胞外基质蛋白来调节施万细胞并促进神经轴突生长，其中旁分泌机制参与了hUCMSCs的细胞疗法，在PNI治疗中起重要作用。另有实验表明，腺病毒载体介导的BDNF向hUCMSCs的离体基因转移，修饰后的hUCMSCs存活时间较长，可维持神经分化，促进挤压伤大鼠坐骨神经轴突再生和功能恢复，且效果优于未转染组，可以用于缺氧缺血性脑损伤后神经功能的恢复，但需要进一步评估神经再生的根本机制及长期治疗效果[45-46]。

3.2.4神经干细胞(neural stem cells，NSCs) NSCs是一种神经组织特异性的前体细胞，存在于脑和脊髓神经系统中，具有多向分化的潜能和自我更新能力，在不同微环境中可分化为神经元、神经胶质细胞、少突胶质细胞。国内研究表明，BDNF通过非脂质体法基因修饰大鼠胚胎NSCs后进行体外诱导分化，基因转染48 h后显示，NSCs形成了双极神经元样细胞，诱导7 d后获得巢蛋白阳性、βⅢ-微管蛋白阳性的NSCs比例明显高于单一NSCs组、外加BDNF诱导组，反转录聚合酶链反应检测BDNF基因表达的增强，证明了NSCs具有体外分泌BDNF的能力，促进了NSCs定向分化为神经元及突触的发生[47]。另有研究表明，大鼠全脑辐照4周后，将慢病毒载体基因修饰的神经干细胞移植入脑组织海马中4周，高比例胶质纤维酸性蛋白阳性的星形胶质细胞广泛分布于海马内，说明移植海马内过表达BDNF的NSCs在辐射所引起恶劣的海马环境中具有整合优势[48]。Kwon等[49]和Moro等[50]应用腺病毒、慢病毒载体介导BDNF修饰NSCs，能够防止中枢神经系统损伤后神经元萎缩，并促进再生相关基因表达。此外，神经生长因子+BDNF+碱性成纤维细胞生长因子的联合使用可显著提高NSCs增殖和分化能力，大幅提高了NSCs治疗效果[51]。可见通过BDNF修饰NSCs用于修复神经效果佳，基因疗法对于治疗中枢和周围神经系统疾病提供了临床思路。

3.2.5肌源干细胞(muscle-derived stem cells，MDSCs) MDSCs是从骨骼肌中分离出的细胞群体，具有成肌、成脂肪、成软骨和成骨等多向分化能力，并有很强的自我更新能力，在长时间连续传代60代仍保持表型不变。MDSCs来源广泛，代表卫星细胞的前身，具有更高的再生能力和细胞存活率，是近年理想的种子细胞。MDSCs在体外可被诱导分化成施万细胞[52]，其与BDNF共培养诱导后[53]神经元数量明显增加，相关分析表明，BDNF水平与神经元损伤之间存在显著的相关性，有助于MDSCs发挥作用，体内植入MDSCs后，受损神经区域的轴突再生，神经元的凋亡减弱，抗氧化剂的表达以及B细胞淋巴瘤/白血病-2和B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白的比例上调，BDNF还可促进MDSCs向神经元样细胞的转化，从而替代受损神经，治疗PNI效果佳。此外，采用脂质体法将SMDF基因转染小鼠MDSCs后与施万细胞共培养诱导分化，被诱导成施万样细胞的阳性率约为89%，明显高于直接诱导的阳性率63%，证实转染可提高诱导效率[54]。目前，BDNF转染MDSCs后诱导神经元样细胞用于坐骨神经损伤修复的研究正在进行中。

3.3iPSC iPSC是指通过不同基因直接导入成体干细胞，并将分化后细胞的细胞核重新编程到未分化状态，最终获得类似ESCs的多能干细胞。iPSC诱导是一种利用转录因子重新编程体细胞的机制[55-56]。iPSC可分化为内胚层、中胚层和外胚层三个胚层型，NSCs[57]可诱导干细胞中的神经分化，并具有修复神经系统的潜力，BDNF通过激活Wnt/β联蛋白和胞外信号调节激酶5信号通路，促进iPSC衍生的NSCs的生长，并分化成疾病特异性的细胞类型，有助于治疗神经元疾病。研究显示，选用腺病毒法将BDNF基因修饰的真皮多能干细胞移植入脊髓损伤局部，镜下可见大量BDNF阳性细胞，3 d后过表达BDNF的iPSC组凋亡率低于单纯BDNF组，根据BBB(Basso,Beattie,Bresnahan)运动量表神经行为学评分法，大鼠神经功能恢复效果明显优于单纯BDNF组，能够更大程度地改善神经损伤修复[58]。但是，iPSC具有潜在的致瘤性，包括致畸胎瘤性和致癌性，因此有必要进行更加高效、稳定的重编程方案[59]。目前产生iPSc的源细胞、基因修饰方法及相关机制正在不断更新，其在基因修饰层面能否对神经产生更好的效果暂无相关研究。

4 小 结

随着组织工程技术蓬勃发展，从全能干细胞ESCs到重新编程的iPSC，经BDNF修饰的细胞大部分均已应用于周围神经再生和修复，目前BDNF转染肌源干细胞治疗神经再生和修复的研究正在进行中。近年PNI修复的研究取得了很大进步，但基因修饰后干细胞修复神经的机制尚不明确，相关研究仍处于临床前研究阶段，且面临一些热点问题，如基因修饰后细胞的变异、应用安全性、基因表达的不稳定性、细胞致瘤性等，随着对基因修饰干细胞研究及科研水平的提高，基因修饰后干细胞移植应用于PNI修复将有广阔的前景。