阿霉素诱导心肌细胞线粒体铁死亡和心脏毒性的研究进展

苏娜，陈日玲

(1.广东医科大学，广东 湛江 524000； 2.广东医科大学顺德妇女儿童医院儿童血液肿瘤科，广东 佛山 528300)

阿霉素是一种蒽环类化疗药物，广泛用于白血病、淋巴瘤、肉瘤等恶性肿瘤的治疗。阿霉素的体内毒素具有剂量依赖性和累积性，其原因是阿霉素对心肌细胞线粒体内膜上的心磷脂具有较高的亲和力[1]。有研究发现，约26%的肿瘤患者在阿霉素累计剂量达到550 mg/m2时会发生阿霉素相关的心脏疾病[2]。此外，在接受阿霉素治疗的老年淋巴瘤和儿童肿瘤幸存者中，超过50%的患者具有心脏毒性的发生风险，对患者远期预后有较大影响[3]。因此，阿霉素引发的心脏损伤已成为目前亟待解决的问题。铁死亡是一种依赖于活性氧类(reactive oxygen species，ROS)生成和铁超载而形成的严重脂质过氧化，这种铁依赖的细胞死亡形式在形态学、生物化学和遗传学方面均不同于细胞凋亡、自噬和坏死[4]。铁死亡的主要特征包括线粒体膜密度浓缩、体积缩小、线粒体嵴减少或消失以及外膜破裂[5-6]。由此可见，线粒体形态改变是铁死亡的重要特征。线粒体是细胞内ROS产生的重要场所，也是细胞内铁调节的主要细胞器。细胞内外信号紊乱可导致线粒体功能障碍，从而改变细胞的命运。因此，在应用阿霉素治疗恶性肿瘤过程中，减少心脏毒性和铁死亡的发生尤为重要。现就阿霉素诱导心肌细胞线粒体铁死亡和心脏毒性的研究进展予以综述。

1 阿霉素诱导心脏氧化应激与线粒体铁代谢及心肌损伤的关系

1.1ROS 氧化应激是阿霉素诱导心肌细胞线粒体铁死亡的一种潜在致病机制，主要由氧化剂与抗氧化剂失衡所致[7]。ROS主要由线粒体代谢产生，包括过氧化氢、超氧阴离子、羟基自由基和过氧亚硝酸盐等[8]。在氧化应激条件下，ROS生成增加可激活细胞毒性信号通路、破坏DNA和蛋白质，导致膜脂过氧化、线粒体功能障碍以及心肌细胞线粒体铁超载，最终致铁死亡和心肌损伤[9]。而芬顿反应是铁死亡发生过程中ROS的主要来源[10-11]。线粒体内生成的ROS通过阿霉素与三价铁离子(Fe3+)结合丢失单个电子，形成阿霉素-二价铁离子(Fe2+)半醌自由基，并于Fe2+与Fe3+间进行氧化还原循环，催化芬顿反应，产生高度不稳定且有毒的羟基自由基，将一个电子从还原化合物转移至过氧化氢[5,12]。由此可见，阿霉素通过破坏电子传递链导致ROS生成增加，使线粒体膜电位发生去极化和线粒体肿胀，最终引起线粒体内铁超载。而新一代线粒体靶向抗氧化剂XJB-5-131可通过阻断线粒体ROS的产生，改善线粒体功能和细胞活力，减少铁死亡的发生[5]。

1.2烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nicotina-mide adenine dinucleotide phosphate oxidase，Noxs) Noxs是一种多亚基跨膜酶，其可利用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸作为电子供体将氧还原并转移至过氧化氢。在所有同源基因中，Nox4在心肌细胞中高表达，其可在特定刺激下(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸水平升高)使ROS的产生显著增加，从而改变细胞内的氧化还原状态和细胞功能[13]。心脏线粒体内的铁转运或输出障碍均可导致铁堆积，从而促进Nox4表达，引起脂质过氧化物过量产生、线粒体萎缩、心肌细胞损害[14]。Chen等[15]研究发现，Nox4激活可导致心力衰竭大鼠ROS生成增加，进而引起心肌细胞线粒体铁代谢紊乱，促进阿霉素诱导的心力衰竭和铁死亡，而Nox4敲除则可显著减少心肌细胞死亡和铁蓄积。表明Nox4靶向治疗可抑制阿霉素诱导的ROS产生，维持心肌细胞线粒体铁平衡，减少心肌细胞损伤和铁死亡。

2 阿霉素诱导脂质过氧化与线粒体铁代谢及心肌损伤的关系

2.1谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPX4) GPX4是一种铁死亡核心调控蛋白，可特异性清除有害超氧化物、过氧化物和羟基自由基，减少细胞膜上多不饱和脂肪酸的过氧化作用。GPX4主要位于线粒体，其表达水平随着脂质过氧化物的积累而下调，而脂质过氧化代谢产物主要包括丙烯醛和丙二醛。Tadokoro等[7]研究表明，线粒体中的阿霉素-Fe2+复合物可诱导经阿霉素处理的小鼠心肌细胞GPX4活性降低，导致脂质过氧化蓄积及丙二醛水平显著升高，最终引起心肌萎缩、心脏收缩功能受限和心肌细胞线粒体铁死亡；研究还发现，在体外培养的心肌细胞中，GPX4过表达可抑制阿霉素诱导的心脏毒性、减少心肌细胞线粒体铁死亡；而GPX4敲除则可加速心脏收缩功能障碍、心肌损伤和铁死亡的发生；此外，使用Fe2+螯合剂还可显著降低经阿霉素处理的小鼠心肌细胞线粒体的铁水平，并抑制阿霉素诱导的脂质过氧化和铁死亡；使用Fe3+螯合剂也可降低线粒体的铁水平，但不能阻止阿霉素诱导的脂质过氧化和心肌细胞死亡。以上研究表明，线粒体是阿霉素诱导的铁死亡中脂质过氧化物产生的主要细胞器；Fe2+螯合剂在阿霉素诱导心肌细胞中线粒体铁代谢起重要作用。

2.2酰基辅酶A硫酯酶1(acyl-CoA thioesterase 1，Acot1) Acot1是脂肪酸代谢中的一种重要酶，可催化脂肪酰基辅酶A转化为辅酶A-SH和非酯化脂肪酸。线粒体是脂质过氧化的主要来源之一，而脂质过氧化可增加心肌细胞ROS的产生。Acot1可降低心肌细胞的氧化应激，减少心脏功能损伤，包括脂多糖诱导的心脏损伤和糖尿病性心肌病；Acot1过表达可抑制阿霉素的细胞毒性，减少心肌细胞脂质过氧化，并防止心肌细胞铁死亡；敲除Acot1后，则心肌细胞阿霉素毒性的敏感性增强[9]。

铁抑制素-1是一种铁死亡抑制剂，其抗铁死亡活性与清除脂质过氧化氢中的亚铁产生的烷氧基自由基有关[16]。铁抑制素-1可通过下调线粒体脂质氧化水平，降低阿霉素诱导的心脏毒性和患者病死率[7]。铁抑制素-1还可通过抑制Acot1下调，减少阿霉素引起的铁死亡和心肌细胞坏死[9]。通过透射电镜观察发现，经阿霉素处理的小鼠铁死亡形态学主要表现为心脏线粒体嵴减少或消失以及线粒体外膜破裂，而应用铁抑制素-1治疗可减轻这些病理变化[17]。阿霉素可诱导心肌细胞铁死亡，而铁抑制素-1可有效防止心脏损伤以及心肌细胞线粒体的超微结构改变，表明Acot1可能是阿霉素治疗中铁死亡的潜在保护因子，这种保护作用可能与其塑造心肌细胞脂质组成的能力有关。因此，Acot1可能成为铁死亡抑制剂预防心脏损害的潜在治疗靶点。

2.3血红素加氧酶-1 血红素加氧酶-1的表达是由核因子红系2相关因子2的激活引起[18]。核因子红系2相关因子2转位至细胞核后，与抗氧化基因(包括血红素加氧酶-1)上游启动子区域的抗氧化反应元件结合，从而启动转录[19]。目前研究者对血红素加氧酶-1的认识仍存在争议。有研究认为，血红素加氧酶-1过表达可保护小鼠心脏免受损伤[20]；也有研究发现，过表达血红素加氧酶-1的转基因小鼠(非野生型的幼仔)在1岁时发生了自发性心力衰竭[21]。另外，血红素加氧酶-1活性的改变对博莱霉素诱导的肺损伤[22-23]和脑出血后的脑损伤[24]均具有保护作用，表明血红素加氧酶-1在多种组织中发挥不同的致病作用。研究发现，阿霉素诱导的核因子红系2相关因子2激活可导致小鼠血红素加氧酶-1表达上调，进而使心脏血红素降解、游离铁释放并在线粒体中积累，从而导致脂质过氧化、铁死亡，最终导致心肌病；而下调血红素加氧酶-1的表达则可减少阿霉素诱发的铁死亡和心脏损伤；研究还发现，血红素加氧酶-1抑制剂或铁螯合剂均可保护心肌细胞线粒体免受阿霉素损害，且与应用血红素加氧酶-1抑制剂或铁螯合剂相比，应用凋亡抑制剂、坏死抑制素-1的小鼠存活率未见显著升高[25]。因此，血红素加氧酶-1抑制剂可有效预防铁离子蓄积于心肌细胞，从而诱发铁死亡。

3 阿霉素破坏线粒体铁代谢相关基因与铁死亡及心脏毒性的关系

3.1铁的转运、储存和利用 铁是生命必需的微量元素之一，食物中的Fe3+在小肠吸收后被还原为Fe2+，与转铁蛋白结合形成转铁蛋白-Fe，转铁蛋白-Fe再与细胞表面的转铁蛋白受体1(transferrin receptor 1，TfR1)结合。一方面，铁离子通过细胞基底膜上的铁转运蛋白(参与细胞铁外排的蛋白)输出至细胞外[5]。另一方面，Fe2+通过二价金属离子转运蛋白和线粒体内部的铁转运蛋白-2介导，将细胞质中的游离铁运送至线粒体基质，用于合成血红素和铁硫簇或储存于线粒体铁蛋白(mitochondrial ferritin，FtMt)中；细胞内的这一系列铁代谢过程均受到与RNA结合的铁调节蛋白(iron regulatory protein，IRP)1/2调控；而铁硫簇主要通过线粒体内膜的ATP结合盒转运蛋白(ATP-binding cassette transporter protein，ABC)B8将转运蛋白转运出去，若线粒体内的铁未及时用于血红素和铁硫簇的合成或储存于FtMt中，则可导致线粒体铁蓄积[26]。阿霉素可诱导心脏毒性，导致线粒体功能障碍和细胞内铁积累，从而引发铁转运、储存和输出紊乱，最终导致铁代谢失调[7]。

3.2IRP1、IRP2和TfR1 细胞中的铁水平受IRP1和IRP2调节，而IRP1和IRP2可控制铁代谢基因的转录后表达。IRP通过与其信使RNA中的铁反应元件(iron-responsive elements，IRE)结合调节铁的摄取、储存和输出[27]。当IRP与5′非翻译区IRE结合时，IRP的翻译被抑制，而IRP与TfR1信使RNA 3′非翻译区的IRE相互作用则可阻止IRP降解；IRP对铁蛋白和TfR1表达的同向与反向调节作用确保了细胞有足够的铁供应，同时也防止了潜在的毒性铁的积累[28]。阿霉素可通过激活IRP1和抑制IRP2两种方式调节大鼠H9C2心肌细胞IRP水平，其中IRP2下调涉及ROS介导的蛋白质降解，IRP1激活是由阿霉素的次生代谢物阿霉素醇引起，而急性治疗则可促进阿霉素转化为糖苷配基[29-30]。经阿霉素治疗的小鼠心脏铁蛋白合成增加、TfR1和IRP2表达下调、IRP1活性增加，导致心肌细胞内游离铁水平降低，减轻对抗心脏氧化损伤，从而减少铁死亡、心脏损伤[28,30]。当细胞处于缺铁状态时，IRP与IRE结合，阻止铁蛋白翻译并下调其表达，从而减少铁储存，避免铁死亡发生；当细胞处于铁超载状态时，IRP不能与IRE结合，导致铁蛋白的翻译抑制被解除，进而导致细胞中铁超载[31]。

3.3ABCB8 ABCB8是ABCB蛋白家族的一员，通过协调线粒体内铁的输出维持线粒体铁平衡及铁/硫蛋白成熟。Ichikawa等[32]发现，经阿霉素处理的新生鼠心肌细胞线粒体内铁蓄积，ABCB8信使RNA及其蛋白质水平均降低；通过细胞活力测定实验和DNA断裂的原位末端标记法染色评估发现，与普通新生鼠相比，经阿霉素处理的ABCB8表达下调的新生鼠心肌细胞铁水平显著升高；另一方面，在体内和体外转基因小鼠心脏中，ABCB8过表达可降低阿霉素诱发的心肌细胞线粒体铁超载和心肌细胞死亡，因此阿霉素引起的心肌细胞线粒体铁代谢紊乱及心肌病均与ABCB表达受到抑制有关；研究还发现，无论在体外还是体内阿霉素均可显著降低ABCB信使RNA和蛋白水平，同时线粒体铁转运蛋白-2水平无显著变化，但铁存储相关的FtMt及其信使RNA水平则显著升高，这可能是机体对线粒体铁水平增加的代偿反应。表明阿霉素引起的心肌细胞铁代谢失衡可能由铁输出减少所致，而不是由铁输入增加导致。

3.4FtMt FtMt具有抗氧化特性，可保护线粒体免受铁介导的氧化损伤，同时降低线粒体游离铁水平和ROS形成，FtMt通过诱导具有抗氧化功能的超氧化物歧化酶2的过度激活而发挥抗氧化活性[33-35]。阿霉素可通过氧化还原循环促进心脏氧化应激，使超氧化物歧化酶2失活，从而降低FtMt表达，导致线粒体内铁积累，出现心脏损害[35]。研究发现，FtMt过表达可抑制阿霉素对铁失衡的作用，抵抗过氧化氢诱导的氧化损伤，减少ROS生成，从而导致线粒体内铁水平降低，进而避免铁死亡、心功能损害的发生[33]。Maccarinelli等[36]发现，敲除FtMt可导致经阿霉素处理的小鼠心脏纤维紊乱、线粒体损伤甚至死亡。表明FtMt可抑制铁进入氧化还原循环，保护细胞免受阿霉素诱导的细胞毒性，维持线粒体内铁代谢，从而预防铁死亡的发生。

4 小 结

阿霉素可治疗多种肿瘤疾病，但心脏毒性限制了其在临床的广泛应用。阿霉素诱导的铁死亡及心脏损伤由多种机制共同作用导致，除ROS生成增加、脂质过氧化外，阿霉素还可通过影响心肌细胞线粒体铁代谢相关基因的表达，导致铁代谢紊乱，最终致铁死亡和心肌细胞不可逆损伤。而铁螯合剂、血红素加氧酶-1抑制剂、线粒体特异性抗氧化剂等均可预防或减轻阿霉素引起的铁死亡、心脏毒性。因此，未来还应进一步深入研究阿霉素诱导心肌细胞线粒体铁死亡的机制，探索新的干预方法和治疗策略，以减少患者心脏毒性的发生。