外泌体靶向给药系统的研究现状

张靖悦，李 云，杨 翀

（1.天津医科大学总医院，天津 300052；2.天津市环湖医院，天津 300350）

外泌体（exosome）是一种直径在30～150 nm范围内的细胞外囊泡，可有效避免单核巨噬细胞的吞噬作用，自由穿过血管壁和细胞外基质，在生理和病理条件下几乎可以由所有细胞类型分泌，被认为是优良的药物传递载体［1］。与体外合成的脂质体和其他纳米递送系统相比，外泌体来源于人体，所携带的蛋白质、miRNA或mRNA等多种成分使其具有介导细胞间通信和相互作用的独特性［2］。受体介导的内吞作用是外泌体与靶组织之间信息交流的主要方式之一，优化外泌体的内吞过程，促进包封药物的内化，有利于血液中内容物的持续稳定转运，提高转运效率。此外，外泌体的膜有多种具有特定功能的膜蛋白，具有很强的靶向性和穿透生物屏障的能力，是非常有前景的靶向载药系统，可用于递送基因药物、化学药物、中药成分等。然而，天然外泌体可能存在靶向性弱、易在体内快速清除等问题，导致治疗效果不佳，因此常将天然外泌体修饰形成工程外泌体，提高靶向性和稳定性。本文将从外泌体分类、制备、储存、载药类型、载药方式和表面修饰的角度解释外泌体靶向给药系统的研究现状。

1 外泌体分类

外泌体根据是否经过人工修饰分为天然外泌体和工程外泌体。天然外泌体分为动物源性外泌体和植物源性外泌体。由于外泌体是在正常和肿瘤条件下产生的，因此动物源性外泌体可进一步分为正常外泌体和肿瘤外泌体。

几乎所有类型的正常细胞都可以产生外泌体，如间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）、巨噬细胞、星状细胞（stellate cells，SC）、自然杀伤（natural killer，NK）细胞等［3］。MSC是能够自我更新和多向分化的多能干细胞，不仅能适应肿瘤微环境，还具有强大的旁分泌活性，能分泌大量外泌体。研究表明［4］，载紫杉醇（paclitaxel,PTX）的外泌体在体外对人胰腺癌细胞系CFPAC-1的增殖具有显著的抑制作用，具有作为药物载体的潜力。巨噬细胞是单核吞噬细胞，在炎症、免疫调节、伤口愈合和血管生成中发挥作用。通常巨噬细胞在体内分布广泛，可极化为M1或M2巨噬细胞。研究发现［5］，巨噬细胞来源的外泌体可以通过影响炎症信号和免疫功能来影响肺组织微环境。此外，Exo-PTX在Lewis肺癌转移模型中具有显著的抗肿瘤作用。通过呼吸途径传递的巨噬细胞来源的外泌体几乎完全与癌细胞的转移共同定位，这表明巨噬细胞来源的外泌体可能具有特定的表面蛋白，并倾向于优先在癌细胞中积累，具体机制仍有待进一步研究［6］。外泌体能够从亲本细胞中继承许多特定的生物分子，这是其异质性的原因之一。不仅如此，不同来源的外泌体在产量、含量、功能、载药量方面也存在一定差异，可能产生不同的治疗效果。Kanchanapally等［7］使用共孵育成功将阿霉素加载到胰腺星状细胞（pancreatic stellate cells，PSC）、胰腺癌细胞和巨噬细胞衍生的外泌体上。相比之下，PSCs来源的外泌体产量最高，载药率高，而巨噬细胞来源的外泌体抗肿瘤活性最强，表明不同来源的外泌体具有特异性。此外，上述正常外泌体可以广泛存在于生物体液中，例如唾液、血浆、尿液、腹水、牛奶和胆汁。目前，乳源性外泌体已成功用于递送化疗药物－PTX，其生物利用度、稳定性、安全性和毒性均已通过测试符合标准［8］。

肿瘤细胞可以分泌大量外泌体，其表面的特异性抗原可以反映供体细胞的性质。因此，肿瘤外泌体在癌症研究中备受关注。肿瘤外泌体不仅在肿瘤生长、转移和免疫调节过程中发挥重要作用，而且还监测疾病的发展并作为疾病的诊断标志物。Wu等［9］发现过表达CAPS1的结直肠癌细胞来源的外泌体可以增强正常结肠上皮细胞的迁移。因此，抑制肿瘤外泌体的分泌是转移性结直肠癌患者的治疗选择。

此外，食品来源的外泌体也具有良好的发展前景。近年来，研究发现植物来源的外泌体样纳米微粒（exosome-like nanoparticles,ELN）具有与哺乳动物外泌体相似的结构。生姜来源的微粒可以预防肝脏相关疾病的发展，葡萄、胡萝卜、柚子和生姜来源的ELN具有抗炎作用，可以维持肠道稳态［10］。

2 外泌体制备

随着外泌体研究的深入，其潜在应用价值不断被挖掘。外泌体的可重复分离和富集有助于评估其生物学功能。然而，由于外泌体在大小、内容、功能和来源方面存在差异性，使得分离变得困难［11］。而且目前大多数分离技术无法将外泌体与具有相似生物特性的脂蛋白和来自非内体途径的细胞外囊泡完全分离，导致外泌体纯度较低。因此，如何高效富集外泌体是当前的重要课题，对于外泌体的下游分析至关重要。针对不同的目的和应用，选择不同的分离方法，其中最常用的方法包括超速离心技术、基于尺寸的分离技术、聚合物沉淀技术、免疫亲和色谱技术。

2.1 超速离心技术 超速离心（ultracentrifugation,UC）是目前应用最广泛的分离技术，也被称为外泌体提取和分离的金标准。UC主要根据原溶液中各组分的大小和密度差异来获得所需组分，因此适用于沉降系数差异显著的大剂量样品组分的分离。UC主要分为两步：首先是连续多次的低中速离心去除死细胞、细胞碎片和大尺寸的细胞外囊泡，然后以100 000×g的离心力分离外泌体，并用磷酸缓冲盐溶液洗涤外泌体以去除杂质。研究发现离心时间、离心力、转子类型以及参数都会影响目标外泌体的产量和纯度［12］。该方法不需要标记外泌体，可以避免交叉污染，但其耗时长、成本高、并且容易造成结构破坏、聚集成块、脂蛋白共分离，不利于下游分析［13］。

2.2 基于尺寸的分离技术 基于尺寸的分离技术主要是指超滤和尺寸排阻色谱（size-exclusion chromatography,SEC），根据外泌体与生物样品中其他成分的大小差异进行分离。超滤方法通常使用不同孔径的超滤膜来选择性分离样品，在外泌体研究中经常起到辅助分离的作用。超滤法通常采用超滤管分离外泌体，其成本低，富集效率高，且不影响外泌体的活性。然而，外泌体和超滤膜存在纯度低和非特异性结合降低回收率的问题，使超滤法的使用受到限制。SEC的分离原理是大分子不能进入凝胶孔，其与流动相沿着多孔凝胶之间的间隙被洗脱，而小分子留在凝胶孔中并最终被洗脱通过流动相。目前，基于SEC原理的qEV分离柱、EVSecond纯化柱、Exo-spin外泌体纯化柱已上市。SEC的应用快速、简单且成本低。分离出来的外泌体结构完整、大小均匀，对其生物学特性没有明显的不利影响，但可能掺杂了其他类似大小的微粒，导致纯度降低［14］。

2.3 聚合物沉淀技术 聚合物沉淀技术通常以聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）为介质，通过降低外泌体的溶解度，在离心条件下收获外泌体。这种方法最初是用来分离病毒的。由于外泌体和病毒具有相似的生物物理特性，因此在科学研究中经常使用这种方法来分离和纯化外泌体。Rider等［15］比较了超速离心、改性聚合物共沉淀（modified polymer co-precipitation,ExtraPEG）和市售商品试剂盒3种技术，结果发现前两种方法优于市售商品试剂盒，且ExtraPEG更具成本效益，在纯度和回收率方面均优于超速离心。ExtraPEG操作相对简单，分析时间短，适合处理大剂量样品，但纯度和回收率较低，容易产生假阳性，产生的聚合物难以去除，不利于后续的功能实验分析。

2.4 免疫亲和色谱技术 免疫亲和色谱（polymer precipitation，IAC）是一种基于抗体和配体特异性结合的分离纯化技术，可将所需物质从混合物中分离出来。结合效率与生物亲和力、洗脱条件和基质载体密切相关。原则上，该方法应用的生物标志物（抗原）应是外泌体膜表面的高丰度蛋白，如四跨膜蛋白超家族、内吞体分选转运复合体相关蛋白等。靶蛋白可以是外泌体表面的一种常见成分，也可以是促进IAC识别特定细胞来源外泌体的特殊成分。与超速离心相比，IAC可以用更少的样品体积产生相似的结果［16］。此外，IAC还可以用于外泌体的定性和定量测定。例如，基于微孔板的酶联免疫吸附分析技术用于富集血清、血浆和尿液等体液中的外泌体，定量检测分析发现，该方法收获的外泌体产量与超速离心相当，但对样品的需求量要更小，从400μl血浆中提取的RNA量与2.5 ml样品超速离心得到的量相同，因此相比超速离心具有一定优势［17］。然而，免疫亲和层析获得的外泌体的储存条件相对苛刻，不适合大规模分离外泌体，基质的非特异性吸附会产生干扰蛋白，使该方法难以推广。

3 外泌体储存

外泌体是一种无细胞疗法，但其难以长期储存。因此，有必要研究外泌体的保存技术，以保护其生物学活性，方便运输和临床应用。目前，应用的储存技术主要有冷冻保存、冷冻干燥和喷雾干燥。

3.1 冷冻保存 冷冻保存是一种将温度降低到生化反应所需温度以下以维持生物微粒功能稳定性的储存方法，通常在4、-80和-196℃的温度下应用。但是这种保存方式容易出现“冻伤”。这里所说的“冻伤”，主要与冷冻过程中渗透作用不平衡以及生物微粒内部形成冰晶有关。为了克服这一不足，通常有选择地添加一种或多种适当浓度的防冻液以延长保质期［18］。

防冻液通常分为渗透性和非渗透性两种。其中，渗透性防冻液分子量小，能穿透细胞膜进入细胞内，防止冰晶的形成，如二甲基亚砜、乙二醇等。从形态学角度讲，直接冷冻会影响外泌体膜的稳定性并促进其降解，而在冷冻保存中添加二甲基亚砜的外泌体则可保持与新鲜外泌体相似。非渗透性防冻液可以与水形成氢键，主要包括海藻糖、蔗糖和其他碳水化合物。糖的玻璃基质可以防止囊泡聚集，减少冰晶造成的伤害。考虑到稳定性，双糖防冻液是外泌体的最佳选择，其中海藻糖被列为最有效的双糖防冻剂［19］。但使用前应检查防冻液的浓度，使其保持适当的浓度，以维持平衡状态，防止不必要的损失。

3.2 冷冻干燥 冷冻干燥是将含有水分的物料预先冷却到冰点以下冻结成固体，在真空下直接使冰升华并以水蒸气的形式除去，从而满足储存要求的技术。冷冻干燥技术主要分为三个阶段：预冷冻阶段、升华干燥阶段和分析干燥阶段。在低温、真空条件下完成脱水干燥，可以保持原有的活性，减少对生物组织和细胞体的损伤。而在冷冻干燥过程中产生的冷冻和脱水压力，可能会造成生物分子的分子结构被破坏。因此，还需要选择性地添加防冻液来保护生物材料。Charoenviriyakul等［20］将B16BL6黑色素瘤的外泌体分成三份，一份直接保存在-80℃，一份加入海藻糖冻干，一份直接冻干，并比较了外泌体的形态、蛋白质含量以及药代动力学，结果发现，海藻糖的加入可有效防止冻干过程中外泌体的聚集，增加稳定性，且不会改变外泌体的形态。而且室温保存的冻干外泌体的蛋白含量与-80℃相似，对药代动力学的影响很小。

3.3 喷雾干燥 喷雾干燥是一种系统地应用于材料干燥的技术。外泌体溶液在干燥室雾化后，水分与热空气接触后迅速蒸发，得到干粉。在此过程中，雾化压力和出口温度是影响外泌体稳定性的主要因素。与冻干相比，喷雾干燥是一个连续的过程，可以实现一步粉碎，并且可以调节干粉的粒度，更经济［21］。

4 载药类型

4.1 化学药物 长久以来，癌症的病死率居高不下，开发高效的癌症治疗策略一直是研究热点。化学药物通过外泌体载药可以在癌症、炎症等多种病理过程中发挥作用。阿霉素，一种两性药物，可以抑制微管生成，控制肿瘤生长，属于广谱抗肿瘤药物。Yang T等［22］使用斑马鱼模型来检查脑内皮衍生的外泌体通过血脑屏障递送阿霉素的功效，图像结果显示，外泌体成功将阿霉素负载通过血脑屏障，并且肿瘤抑制作用明显。此外，卟啉、替拉扎明、多西紫杉醇和顺铂等抗癌药物也可以通过外泌体发挥作用［23-24］。

过氧化氢酶（catalase，CAT）是最有效的抗氧化剂之一，可以有效抑制炎症，保护多巴胺能神经元，用于治疗神经退行性疾病。在研究CAT对帕金森病的治疗效果时，Haney M J等［25］发现，采用外泌体包裹CAT不仅可以保持生物活性，增强稳定性，降低免疫原性，延长血液循环时间，而且还可以有效降低氧化应激，提高帕金森病体内和体外模型中神经元的存活率。总之，Exo-CAT制剂有望成为治疗神经退行性疾病的通用策略。

4.2 中药成分 中药，包括单体活性成分和复方制剂，因其较低的毒副作用，已被广泛用于外泌体递送系统的研究。PTX对多种恶性肿瘤均具有良好的治疗作用，但因其高度疏水性，生物利用低，且毒副作用呈剂量依赖性，限制了临床应用［8］。近年，使用外泌体递送PTX的研究已被广泛报道。Wang P等［26］选择经典活化的M1型巨噬细胞衍生的外泌体作为载体递送PTX，可以降低PTX的毒性并提高生物利用度。PTX不仅成功递送至小鼠肿瘤组织，而且还通过激活NFκB通路建立促炎环境增强PTX的治疗效果。姜黄素是一种亲脂多酚化合物，溶解度低、稳定性差、代谢快、半衰期短、生物利用度较低，难以在临床广泛使用。Sun D等［27］将姜黄素装载到外泌体上形成复合物，通过提高姜黄素的溶解性、稳定性和生物利用度，使姜黄素的抗炎活性增强，并且这种复合物还可以抵抗小鼠脂多糖诱导的感染性休克。此外，关于外泌体装载中药成分增强疗效、改善耐药性的研究还有很多。例如，装载花青素的外泌体对卵巢癌细胞的增殖具有良好的抑制活性，装载梓醇的外泌体可以加强神经保护作用，外泌体装载β-榄香烯不仅可以抑制肿瘤细胞的增殖和迁移，还可以改善耐药性［28-29］。

5 载药方式

根据治疗药物是否直接装载在外泌体上，载药类型主要分为两类：分泌前载药和分泌后载药。分泌前药物装载是指治疗药物直接装载在亲代细胞上以分泌工程外泌体。此类操作简单，但无法控制载药效率，并可能破坏膜蛋白的天然生理功能。分泌后载药是指将治疗药物以某种方式直接添加到外泌体中，但可能存在外泌体聚集、膜损伤和产率低等问题［24，30］。电穿孔和超声波处理是最常用的载药方法。而外泌体的载药率可能与药物的疏水性、载药方法、外泌体的脂质组成等有关［23］。因此，在实际研究中，主要根据药物的理化特性选择合适的载药方法。

5.1 电穿孔 电穿孔是将外泌体和治疗剂药物的悬浮液暴露在电场中，外泌体膜在短暂的高压脉冲下产生临时孔，治疗药物将渗透到外泌体中。电穿孔是一种相对成熟的方法，简单省时，可用于将核苷酸、阿霉素等药物装载到外泌体中［31］。外泌体浓度会影响电穿孔的效率。Wahlgren J等［32］使用来自外周血的外泌体作为载体通过电穿孔传递治疗性siRNA，实验中研究了外泌体浓度、siRNA浓度和电穿孔参数对电穿孔效率的影响，发现siRNA和电容的变化不影响电穿孔效率，当外泌体浓度在0.25～1 mg/ml范围时，电穿孔效率最高。电穿孔载药方法容易破坏膜结构完整性、降低加载效率、加载速率低，并且使用高压脉冲会导致外泌体聚集，破坏蛋白质结构，影响外泌体活性。

5.2 共孵育 共孵育主要有两种形式。一种是将治疗药物与亲本细胞共孵育，通过亲本细胞的内吞作用将细胞质中的部分治疗药物装载到分泌的外泌体中。另一种是外泌体和治疗药物在适当条件下直接混合共孵育。加载效率主要取决于溶液中药物的浓度梯度及其疏水性。高浓度的疏水性药物通常具有较高的负载效率［25］。该方法操作简单，重现性强，不影响外泌体膜结构的完整性，但加载效率低，需要大量治疗剂。此外，还需要研究治疗剂是否对亲本细胞有毒副作用，并通过改变外泌体的表面电荷来影响稳定性。

5.3 超声波处理 超声波处理载药方法效率高，可以持续释放药物，尤其是疏水性药物，可以防止蛋白酶的破坏。但这种方法可能会导致外泌体聚集，影响其免疫活性，不仅对仪器要求高，而且可能会破坏外泌体的质膜结构，导致药物渗漏，使载药量不理想。超声处理可能会改变膜的高刚性，外泌体膜的重组导致高装载效率和持续的药物释放。Kim M S等［6］比较了共孵育、电穿孔和超声处理三种装载方式的装载率，结果发现超声处理的外泌体装载能力最高，证实了上述假设。同样，Salarpour S等［33］关于37℃共孵育和超声处理对疏水性药物PTX包封率的影响进行研究，结果发现超声处理的负载量［（9.21±0.41）ng/μg］高于共孵育的负载量［（7.40±0.40）ng/μg］。

6 表面修饰

表面修饰是将外泌体表面蛋白作为锚定装置或亲和标签，将符合要求的蛋白质或肽成分通过一定的手段修饰到颗粒表面的过程。天然外泌体如果由于稳定性差、消除快等缺点而无法有效递送药物或靶向应用，则需要进行表面修饰［34］。外泌体的最大优势之一是内源性，可以避免引起免疫反应等不良表现。然而，外泌体递送的效率受亲代细胞和受体细胞的影响，不同来源的外泌体产量存在显著差异，天然外泌体存在靶向性差的问题。为了满足实验需要，通过表面修饰制造工程化外泌体是一种具有实际应用价值的方式。对具有靶向配体的外泌体表面工程化可以帮助其选择性递送至靶细胞，使外泌体在产量和靶向治疗方面达到标准，从而实现外泌体的精准治疗，加速外泌体的临床应用。

为了使治疗药物可以精确到靶向病灶，近年来常用的方法包括靶向肽的化学连接、基因工程修饰外泌体膜、磁性纳米粒子技术、静电相互作用和后插入。表面修饰的外泌体具有一定的优势，但也有一定的局限性。首先，外泌体的表面修饰不能改变外泌体的结构和表面分子，而化学连接的靶向肽有可能改变外泌体的表面结构。其次，转基因亲代细胞操作复杂，转染效率低，容易影响膜蛋白原有的生物活性。当外泌体用病毒来源的蛋白质或肽进行修饰时，需要评估对自身是否有不良反应。此外，用于静电相互作用的阳离子纳米材料可能会引起细胞毒性并且负载效率相对较低。

基于目前流行的表面修饰方法的局限性，尹教授团队［35］筛选出噬菌体CP05偶联靶向分子（M12、RVG、SP94）形成嵌合肽，然后与外泌体表面的CD63结合，对外泌体进行表面修饰。该方法不仅可以提高对外泌体的捕获量，而且还可以增强靶向性，使修饰后的外泌体分别富集在肌肉、脑和皮下肿瘤中。CP05修饰的外泌体在生理特性上没有明显变化，没有改变外泌体的结构和表面分子，有望用于临床癌症的快速检测和治疗药物的有效载体。此外，Tamura R等［36］利用阳离子化支链淀粉修饰外泌体，使其具有靶向肝细胞去唾液酸糖蛋白受体的能力，有助于实现外泌体的精准治疗，提高治疗效果。Lee J等［24］还优化了化学连接和靶向肽的方法，用叠氮化物-膜融合脂质体（membrane-fused liposomes，MFL）处理亲代细胞以产生叠氮化物-外泌体，然后通过生物正交反应将其与肿瘤靶向肽偶联物DBCO-CGKPK连接。这种工程化的外泌体可用于在内部和外部的加载治疗，并可进行多种功能修改。用于表面修饰的MFL的外源性掺入不会影响在外泌体的生物学功能中起决定性作用的膜蛋白。

工程外泌体在药物递送应用中并不具有绝对优势。有研究发现，用相同的加载方法加载胆固醇修饰的siRNA，分别制备工程化外泌体和阴离子融合脂质体，比较其递送能力，结果显示，工程外泌体无法在功能上传递相关的siRNA，而阴离子融合脂质体则可以诱导siRNA介导的靶基因敲除［37］。因此，在考虑是否应用工程外泌体时，需要结合实际情况，深入了解分子转移机制和特异性，选择合适的递送方式。

近年，在外泌体靶向给药方面取得的突破引起了全世界研究人员的广泛关注。越来越多的证据证明外泌体是可靠的药物递送系统。与脂质体、纳米颗粒、微球、微乳等合成载药系统相比，外泌体载药系统具有其独特的优势，包括降低免疫原性、增强组织渗透性、可变形的细胞骨架以及与细胞膜的相似性。然而，外泌体亦存在免疫抑制和逆转肿瘤发生等相关的风险，因此，对外泌体进行修饰，探索安全有效的工程化外泌体是必经的途径。对于外泌体的靶向递送，目前仍然缺乏对导致外泌体选择性细胞摄取的决定因素和影响其细胞内分布的因素的全面了解，未来仍需要广泛的研究来优化外泌体作为药物递送载体的靶向性。此外，还需要注意的是，外泌体载药系统的实验室研究和临床产业化研究之间存在显著性差异，实验室成果如何进行产业化转换亦是研究难题。相信随着工程外泌体的发展以及载药输运机制的完善，外泌体载药系统将在临床上得到广泛应用。