丹参川芎嗪通过调控miR-214-3p对脂多糖引起星形胶质细胞炎症因子释放和神经元凋亡的影响

吕文海，薛世斌，郑涛

1.西安凤城医院神经外科，陕西 西安 710000；2.西安国际医学中心医院神经外科，陕西 西安 710000

星形胶质细胞是神经系统中数量最多的神经胶质细胞，参与调控多种中枢神经系统疾病的进展[1]。肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)能够激活星形胶质细胞，使其释放大量的炎性因子毒害神经细胞，诱导神经细胞凋亡和坏死，进而引起一系列的中枢神经系统疾病[2]。而脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分，能够导致星形胶质细胞炎症损伤[3]。丹参川芎嗪是由丹参和川芎嗪构成的复方制剂，两者均具有神经保护作用，临床上常用于脑血栓的治疗[4]。研究显示，丹参川芎嗪可有效用于急性脑梗死的治疗，还可抑制炎性反应[5]。丹参川芎嗪联合前列地尔对神经功能缺损的改善作用显著，且可改善患者的预后[6]。研究发现miRNA与胶质细胞的炎症反应相关[7]。研究报道，miR-214在LPS诱导的小鼠急性肺损伤模型中具有促炎作用[8]。miR-214-3p可通过下调组织蛋白酶B(Cathepsin B，CTSB)的表达降低多巴胺能神经元的活力[9]。然而miR-214-3p对炎症因子的影响还尚不清楚。本实验通过LPS刺激星形胶质细胞，旨在研究丹参川芎嗪对LPS引起星形胶质细胞炎症因子释放和神经元凋亡的影响，及其是否通过调控miR-214-3p影响星形胶质细胞炎症因子释放和神经元凋亡。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂 星形胶质细胞HA1800购自上海冠导生物工程有限公司；丹参川芎嗪注射液购自贵州拜特制药有限公司；脂多糖(LPS)购自美国Sigma公司；DMEM培养基、1%青霉素/链霉素购自美国Gibico公司；四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)试剂盒、酶联免疫吸附试剂盒(ELISA)购自美国ScienCell公司；二辛可宁酸(BCA)试剂盒、Annexin V-FITC/PI试剂盒购自上海碧云天公司；荧光定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司。miR-con、miR-214-3p、anti-miR-con、anti-miR-214-3p由上海基屹生物科技有限公司构建。

1.2 方法

1.2.1 原代星形胶质细胞的培养与分组 星形胶质细胞HA1800用含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的DMEM培养液培养，用10μg/L的LPS处理HA1800细胞6 h作为LPS组，以正常培养的细胞作为对照(NC)组；分别用5 mL/L、10 mL/L、20 mL/L丹参川芎嗪注射液(SML)处理24 h后再用10μg/L LPS处理3 h分别作为LPS+5 mL/L SML组、LPS+10 mL/L SML(LPS+SML)组、LPS+20 mL/L SML组；将miR-con、miR-214-3p转染至HA1800中再用10μg/L LPS处理，分别记为LPS+miR-con组、LPS+miR-214-3p组；将anti-miR-con、anti-miR-214-3p转染至HA1800中用10 ml/L丹参川芎嗪注射液处理24 h后再用10μg/L LPS处理3 h，分别记为LPS+SML+anti-miR-con组、LPS+SML+anti-miR-214-3p组。

1.2.2 MTT试剂盒检测细胞存活率 各组细胞培养48 h，按试剂盒说明操作，酶标仪检测490 nm处各孔吸光度(OD)值。以实验组和对照组OD值的比值作为细胞存活率(%)。

1.2.3 ELISA法检测TNF-α、IL-6水平 取各组细胞培养48 h的上清液，然后严格按照试剂盒说明操作进行检测。

1.2.4 Western Blot检测裂解半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cleaved-caspase-3)蛋白表达水平 提取细胞总蛋白，通过聚丙烯凝胶电泳分离蛋白，转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，加入Cleaved-caspase-3的一抗4℃孵育过夜，加入二抗室温孵育90 min，然后加入ECL化学发光液显影成像，最后分析蛋白条带灰度值，计算蛋白相对表达水平。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡 收集培养48 h细胞，漂洗后按试剂盒说明操作加入Annexin V-FITC和PI，避光孵育后上流式细胞仪检测。

1.2.6 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测miR-214-3p表达水平 提取细胞总RNA，合成cDNA后按试剂盒说明进行PCR，以U6为内参，用2-△△Ct法计算miR-214-3p的相对表达量。miR-214-3p上游引物序列：5'-CTATGTCCTCACCGAACGCAACC-3'，下游引物序列：5'-CAGCAGGCACAGACAGGC-3'；U6上游引物序列：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物序列：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.3 统计学方法 应用SPSS20.00统计软件进行数据统计分析。计量资料符合正态分布，以均数±标准差(±s)表示，两两间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度SML对LPS处理的星形胶质细胞HA1800活性的影响 与对照组比较，LPS组的细胞存活率升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与LPS组比较，不同浓度SML和LPS共处理组的细胞存活率降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 不同浓度SML对LPS处理的星形胶质细胞HA1800活性的影响(±s，n=3)

表1 不同浓度SML对LPS处理的星形胶质细胞HA1800活性的影响(±s，n=3)

注：与NC比较，a P<0.05；与LPS比较，b P<0.05。

组别NC组LPS组LPS+5 ml/L SML组LPS+10 ml/L SML组LPS+20 ml/L SML组F值P值细胞存活率(%)100.00±10.10 151.26±15.10a 140.11±13.52b 125.02±12.01b 113.26±11.16b 24.130 0.000

2.2 SML对LPS处理的星形胶质细胞HA1800炎症因子释放和神经元细胞凋亡的影响 与对照组相比，LPS组星形胶质细胞中TNF-α和IL-6水平升高，Cleaved-caspase-3表达水平及细胞凋亡率升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与LPS组相比，LPS+SML组TNF-α和IL-6水平降低，Cleaved-caspase-3表达水平及细胞凋亡率降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图1和表2。

图1 SML对LPS处理的星形胶质细胞HA1800炎症因子释放和神经元细胞凋亡的影响

表2 SML对LPS处理的星形胶质细胞HA1800炎症因子释放和神经元细胞凋亡的影响(±s，n=3)

表2 SML对LPS处理的星形胶质细胞HA1800炎症因子释放和神经元细胞凋亡的影响(±s，n=3)

注：与NC比较，a P<0.05；与LPS比较，b P<0.05。

组别NC组LPS组LPS+SML组F值P值细胞凋亡率(%)8.01±0.80 28.63±2.88a 12.01±1.21b 310.462 0.000 TNF-α 1.00±0.10 2.35±0.24a 1.20±0.12b 174.787 0.000 IL-6 1.05±0.13 3.21±0.32a 1.42±0.14b 259.393 0.000 Cleaved-caspase-3 0.35±0.04 0.96±0.10a 0.48±0.05b 197.681 0.000

2.3 SML对miR-214-3p表达的影响 与对照组相比，LPS组的miR-214-3p表达水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与LPS比较，LPS+SML组的miR-214-3p表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 SML对miR-214-3p表达的影响(±s，n=3)

表3 SML对miR-214-3p表达的影响(±s，n=3)

注：与NC比较，a P<0.05；与LPS比较，b P<0.05。

组别NC组LPS组LPS+SML组F值P值miR-214-3p 1.00±0.10 0.32±0.03a 0.92±0.09b 196.295 0.000

2.4 高表达miR-214-3p对LPS处理的星形胶质细胞HA1800炎症因子释放和神经元细胞凋亡的影响 与对照组相比，LPS组的miR-214-3p表达水平降低，TNF-α和IL-6水平升高，Cleaved-caspase-3表达水平及细胞凋亡率升高，差异均具有统计学意义(P<0.05)；与LPS+miR-con组相比，LPS+miR-214-3p组的miR-214-3p表达水平升高，TNF-α和IL-6水平降低，Cleaved-caspase-3表达水平及细胞凋亡率降低，差异均具有统计学意义(P<0.05)，见图2和表4。

表4 高表达miR-214-3p对LPS处理的星形胶质细胞HA1800炎症因子释放和神经元细胞凋亡的影响(±s，n=3)

表4 高表达miR-214-3p对LPS处理的星形胶质细胞HA1800炎症因子释放和神经元细胞凋亡的影响(±s，n=3)

注：与NC比较，a P<0.05；与LPS比较，b P<0.05。

组别NC组LPS组LPS+miR-con组LPS+miR-214-3p组F值P值TNF-α 1.00±0.11 2.42±0.24a 2.40±0.24 1.36±0.14b 128.896 0.000 miR-214-3p 1.00±0.13 0.35±0.04a 0.36±0.05 0.86±0.09b 140.402 0.000 Cleaved-caspase-3 0.35±0.04 0.95±0.10a 0.96±0.11 0.48±0.05b 137.450 0.000 IL-6 1.08±0.11 3.26±0.33a 3.31±0.33 1.42±0.15b 199.696 0.000细胞凋亡率8.15±0.82 26.38±2.65a 28.01±2.88 11.83±1.68b 193.993 0.000

图2 Western Blot检测Cleaved-caspase-3表达

2.5 低表达miR-214-3p可以逆转SML对LPS处理的星形胶质细胞HA1800炎症因子释放和神经元细胞凋亡的影响 与LPS组相比，LPS+SML组的miR-214-3p表达水平升高，TNF-α和IL-6水平降低，Cleaved-caspase-3表达水平及细胞凋亡率降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与LPS+SML+anti-miR-con组相比，LPS+SML+anti-miR-214-3p组的miR-214-3p表达水平降低，TNF-α和IL-6水平升高，Cleaved-caspase-3表达水平及细胞凋亡率升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图3和表5。

表5 低表达miR-214-3p可以逆转SML对LPS处理的星形胶质细胞HA1800炎症因子释放和神经元细胞凋亡的影响(±s，n=3)

表5 低表达miR-214-3p可以逆转SML对LPS处理的星形胶质细胞HA1800炎症因子释放和神经元细胞凋亡的影响(±s，n=3)

注：与NC比较，a P<0.05；与LPS比较，b P<0.05。

组别NC组LPS组LPS+miR-con组LPS+miR-214-3p组F值P值TNF-α 1.00±0.10 0.42±0.04a 0.40±0.05 0.89±0.10b 145.631 0.000 miR-214-3p 1.00±0.12 2.35±0.24a 2.40±0.25 1.35±0.14b 117.002 0.000 Cleaved-caspase-3 0.96±0.10 0.45±0.03a 0.46±0.04 0.85±0.09b 121.515 0.000 IL-6 1.05±0.12 0.35±0.04a 0.38±0.05 0.90±0.09b 173.143 0.000细胞凋亡率27.01±2.70 12.05±1.21a 12.11±1.25 23.31±2.43b 131.628 0.000

图3 Western Blot检测Cleaved-caspase-3表达

3 讨论

以胶质细胞激活为主要特征的炎症反应与神经退行性疾病的发生发展密切相关，抑制星形胶质细胞炎症因子的释放有利于改善和治疗神经系统疾病[10-11]。有研究报道川芎嗪具有保护神经元细胞损伤的功能[12]；丹参及其有效成分具有抑制神经细胞凋亡、改善脑缺血以及减轻脑梗死的作用[13]。有研究发现由丹参和川芎嗪构成的丹参川芎嗪注射液能明显降低急性颅脑损伤患者的TNF-α、IL-6、IL-8水平，对改善患者的临床症状有良好疗效，且安全性高[14]。丹参川芎嗪注射液还能抑制机体炎症反应，有效促进患者的神经功能、认知功能能力[15]。丹参川芎嗪注射液可通过抑制细胞凋亡、抗氧化应激等保护Aβ诱导的PC12细胞损伤[16]。本实验用LPS处理星形胶质细胞促使细胞凋亡和炎症因子TNF-α、IL-6的释放，引发炎症反应。丹参川芎嗪注射液预处理后，LPS作用的星形胶质细胞的存活率降低，TNF-α和IL-6水平降低，细胞凋亡率降低；说明丹参川芎嗪注射液可抑制LPS诱导的神经元细胞凋亡和炎性因子的释放。

研究表明miRNA不仅参与细胞凋亡，还与炎症反应有关。有研究报道上调miR-214可抑制炎症细胞因子的产生[17]。miR-214可抑制异丙酚诱导的神经细胞凋亡[18]。本实验结果显示，LPS诱导的星形胶质细胞中miR-214-3p表达下调。过表达miR-214-3p可降低TNF-α和IL-6水平，降低细胞凋亡率；说明过表达miR-214-3p可抑制LPS诱导的神经元细胞凋亡和炎性因子的释放。还有研究报道显示，葛根素可通过上调miR-214减轻缺氧导致的神经干细胞损伤[19]。川芎嗪通过下调miR-214-3p减轻了受损脊髓的神经细胞凋亡[20]。本实验结果显示，丹参川芎嗪注射液处理后，miR-214-3p表达水平升高；而抑制miR-214-3p表达逆转了丹参川芎嗪注射液对LPS诱导的神经元细胞凋亡和炎性因子的抑制作用。表明丹参川芎嗪可能通过调控miR-214-3p的表达影响神经元细胞的凋亡和炎性因子的释放。

综上所述，丹参川芎嗪可抑制星形胶质细胞HA1800活性，抑制LPS引起的神经元细胞凋亡和炎性因子TNF-α和IL-6的释放。其机制可能与上调miR-214-3p的表达有关。