坡柳皂苷对大菜粉蝶中肠组织的影响

于 航，李丰超，李金梁，秦小萍*，刘全俊

(1.云南农业大学 植物保护学院,云南 昆明 650201；2.云南农业大学 水利学院，云南 昆明 650201)

0 引言

大菜粉蝶(Pierisbrassicae)属鳞翅目(Lepidoptera)粉蝶科(Pieridae)，又名欧洲粉蝶、甘蓝粉蝶、大白蝶，其幼虫俗称甘蓝毛虫，寄主为油菜、白菜、萝卜和甘蓝等十字花科植物，危害特点为小龄幼虫群集于叶背啃食叶肉，龄期大后则分散成小群暴食叶片，甚至连叶脉和叶柄都吃光，严重影响了油菜和蔬菜的质量和产量(吴祖银等[1]，1982)。大菜粉蝶(Pierisbrassicae)是十字花科蔬菜上的主要害虫之一，目前对其仍以化学农药防治为主，不合理的施用方式以及大剂量、多次施药，造成了害虫抗性逐年升高、农药残留等问题。因此，开发防治大菜粉蝶的植物源农药，了解植物源农药作用机制，探究坡柳皂苷对大菜粉蝶中肠组织的影响具有重要的意义。坡柳皂苷是一种从坡柳种子中提取出来的齐墩果烷型三萜皂苷、萜烯类物质。学者们研究发现坡柳皂苷具有抗炎症(Arun等[2]，2008；Bernays等[3]，2001)和抗溃疡(Getie等[4]，2003；Khalil等[5]，2006)的活性，之后也有学者研究发现其具有抗虫活性。在杀虫作用研究中发现，坡柳皂苷对大菜粉蝶幼虫具有较强的拒食作用(张余杰等[6]，2014)。秦小萍等[7](2007)研究发现：坡柳种子的乙醇提取物对小菜蛾具有非选择性拒食作用，对菜青虫的生长发育有影响。杨美林等[8](2003)研究得出：坡柳乙醇提取物对小菜粉蝶4龄幼虫24 h选择拒食作用的AFC50值为691.6 mg/L，完全拒食作用的AFC50值为398.0 mg/L。付立新[9](2010)、秦小萍[7]等(2015)从坡柳种子中分离鉴定了拒食活性成分坡柳皂苷A(图1)，齐墩果烷三萜皂苷类物质含量为7.89%。代玉玲等[10](2012)通过正交设计优选出坡柳(总)皂苷提取方法。廉喜红等[11](2005)发现苦皮藤素对粘虫中肠肠壁细胞的内膜和质膜系统有一定影响，在苦皮藤素作用下，试虫的柱状细胞顶膜微绒毛出现扩张、线粒体膨大肿胀、粗面内质网囊泡化、杯状细胞与柱状细胞之间的间隙增大。周琳等[12](2009)发现雷公藤总碱对粘虫的中肠细胞及细胞器有一定的影响，表现为微绒毛混乱脱落、线粒体肿胀、双层膜不完整、内质网膨大囊泡化。本课题组在研究前期发现，坡柳皂苷对鳞翅目昆虫具有拒食作用以及胃毒作用，对坡柳皂苷的杀虫机制研究较少。研究发现，使用较高浓度处理大菜粉蝶幼虫，会使部分试虫在短期内出现死亡的现象，猜测在较高浓度下，坡柳皂苷对大菜粉蝶幼虫有一定的胃毒活性，本文研究了坡柳皂苷对大菜粉蝶中肠的影响，以揭示其对胃毒作用的贡献。

图1 坡柳皂苷A结构图

1 材料与方法

1.1 试虫

大菜粉蝶幼虫：人工累代饲养后挑选蜕皮后第一天的5龄幼虫。

1.2 试剂

坡柳皂苷为本实验室自行制备，其中齐墩果烷型皂苷含量为61%。

浓度为2.5%的戊二醛、pH值为7.2～7.4的PBS缓冲液、国产分析乙醇。

1.3 方法

1.3.1 试虫处理 挑选蜕皮后第一天的5龄幼虫，饥饿6 h，处理组试虫以载毒叶碟法饲喂(吴文君[13]，1988)(用1 mg/mL坡柳皂苷水溶液浸渍直径为1.2 cm的叶碟1 s，待溶剂挥发后，喂虫，一虫一叶)，分别于虫取食完成24和48 h后，取幼虫中肠制备样品，对照组试虫饲喂同样大小浸泡过水溶液的叶碟。

1.3.2 标本制备 分别取处理组(24和48 h)及对照试虫，在冰盘上快速解剖，取出中肠，4 ℃下将中肠组织投入戊二醛中进行48 h前固定，PBS溶液洗脱，锇酸后固定，PBS溶液洗脱，梯度酒精(30%、50%、70%、90%、100%)脱水，包埋剂包埋，在常温下和60 ℃烘箱中各聚合48 h，醋酸铀和柠檬酸铅进行双重染色。

1.3.3 生物显微镜观察 将样品切成半薄切片，在生物显微镜下观察并拍照。

1.3.4 透射电镜观察 将样品切成超薄切片，在透射电子显微镜下观察并拍照。

2 结果与分析

2.1 坡柳皂苷对大菜粉蝶幼虫显微结构观察

由图2可知，，取食正常饲料的大菜粉蝶幼虫肠中没有滞留食物残渣，围食膜依然存在，中肠细胞除只表现出稍有皱缩、分泌液滴增多外，并无其他明显的病变(图2-a-1、图2-a-2)。取食1 mg/mL坡柳皂苷24 h后，中肠组织开始发生变化，处理试虫的围食膜消失，肠内壁微绒毛消失(图2-b、图2-c)，48 h后的病变更为明显。食物和中肠组织接触甚至可穿透中肠细胞层。中肠细胞病变的表现为先稍加厚，变得无明显细胞层次，继而脱落(图2-b)，直至最后肠细胞组织全部脱落、消融而仅剩下环肌层(图2-c)。解剖时，幼虫的中肠组织极易断裂，也证明了纵肌受到了破坏。

a-1.对照24 h×200,a-2.对照48 h×200,b.处理24 h×200,c.处理48 h×200,Vc.中肠细胞,lm.纵肌,cm.环肌,f.微绒毛,fa.脂肪体

2.2 坡柳皂苷对大菜粉蝶幼虫环肌与底膜的影响

由图3可知，取食正常叶碟的大菜粉蝶幼虫的环肌与底膜紧密的联系在一起，通过图3-A1取食1 mg/mL坡柳皂苷24 h后，环肌与底膜开始分离(图3-B1)，取食1 mg/mL坡柳皂苷48 h后，底膜脱落、消融，试虫仅剩下环肌层。

A1.环肌(cm)与底膜(b)×10000,B1.环肌(cm)与底膜(b)×10000

2.3 坡柳皂苷对大菜粉蝶幼虫微绒毛的影响

由图4可知，取食正常叶碟的大菜粉蝶幼虫中肠杯状细胞微绒毛数量众多，排列紧密整齐(图4-A4)，取食1 mg/mL坡柳皂苷24 h后，大菜粉蝶幼虫中肠细胞微绒毛肿胀变形，断裂脱落(图4-B3)。

A4.整齐排列的微绒毛(m)×10000,B3.微绒毛(m)脱落×10000

2.4 坡柳皂苷对大菜粉蝶幼虫细胞器的影响

由图5可知，取食正常叶碟的大菜粉蝶幼虫中肠内细胞器发达排列整齐有序(图5-A2)，取食1 mg/mL坡柳皂苷48 h后，中肠内各种细胞器均变形，并被溶酶体包围而溶解(图5-C1、图5-C2)。

A2.细胞内丰富的细胞器×10000,C1.被溶酶体(ly)包围的细胞器×15000,C2.同C1×30000

2.5 坡柳皂苷对大菜粉蝶幼虫光面内质网的影响

由图6可知，取食正常叶碟的大菜粉蝶幼虫光面内质网发达且排列整齐有序(图6-A3)，而取食1 mg/mL坡柳皂苷24 h后，大菜粉蝶幼虫的光面内质网膨胀(图6-B2)，取食1 mg/mL坡柳皂苷48 h后，大菜粉蝶幼虫的光面内质网相比较于取食坡柳皂苷24 h后更加膨大(图6-C3)。

A3.光面内质网(ser)×30000,B2.光面内质网(ser)×30000,C3.膨大的光面内质网(ser)×30000

3 讨论

本研究通过透射电镜观察了大菜粉蝶取食坡柳皂苷后中肠细胞内部的变化，发现1 mg/mL坡柳皂苷对大菜粉蝶幼虫的肠壁细胞及其细胞器均产生了影响。在1 mg/mL坡柳皂苷的作用下，大菜粉蝶幼虫围食膜和微绒毛消失，肠细胞与底膜分离，腔内出现大量空泡，溶酶体活动剧增，细胞器及细胞体出现自溶，光面内质网极度膨大。与已报道的川楝素对菜青虫的中肠系统影响基本一致(张兴等[14]，1991)。

本研究发现，1 mg/mL坡柳皂苷所导致的中肠组织病变与拒食作用无关，通过生物显微镜观察后发现，48 h对照组的大菜粉蝶幼虫中肠组织完好，并没有表现出任何病变的情况，证明取食了1 mg/mL坡柳皂苷的幼虫中肠的病变并不是由于拒食作用的影响。中肠组织的自溶是引起病变的主要原因。电镜观察结果表明，试虫取食了1 mg/mL坡柳皂苷24 h后，中肠开始发生变化，微绒毛消失，溶酶体活动剧增，细胞器及细胞体发生自溶现象，这可能是后来引起中肠细胞溶解脱落的原因，但还需要对某些引起自溶的酶进行分析，以便进一步确认。

光面内质网形态上的病变与多功能氧化酶有关。昆虫中肠内的微粒体多功能氧化酶是分解外源毒物的主要酶系，而光面内质网是微粒体的主要组成部分。光面内质网的病变可能标志着分解外源毒物功能的降低，但还需要进行MFO活性测定，以便进一步确认。

总之，通过对中肠组织较系统的观察，证明了取食1 mg/mL坡柳皂苷后，大菜粉蝶幼虫消化系统的正常功能受到了干扰，中肠组织受到严重破坏而发生脱落、自溶。坡柳皂苷对中肠这一消化系统主要器官的影响是引起昆虫死亡的一个重要原因。

4 结论

大菜粉蝶4龄幼虫取食坡柳皂苷24和48 h后，中肠组织发生了明显的病变，说明这是坡柳皂苷对大菜粉蝶产生胃毒作用的靶点之一。