微小RNA-7-5p靶向调节锌指蛋白核转录因子4基因抑制口腔鳞状细胞癌细胞增殖和诱导凋亡的体外研究

尚念红

口腔癌是最常见的头颈癌类型，口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）占口腔癌总数的约90%，全世界每年诊断出新病例超过30万。虽然OSCC 的诊断和临床治疗方面取得了一定进步，但OSCC 病人的5年总生存率无显著提高，仍然小于50%。因此，探究OSCC发生和进展的分子机制对于鉴定新的、有效治疗靶标是必不可少的。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类内源性、小的非编码RNA分子，长度约为22个核苷酸。它们通过与靶mRNA 的3′非翻译区（3′-UTR）中的互补序列结合并调节转录后或翻译水平的基因表达来影响肿瘤的生物学过程。目前已证明多种miRNA 参与OSCC 的生理和病理过程，包括细胞增殖、凋亡、迁移、代谢和分化。例如，如miR-133a-3p 在OSCC 中的表达降低并充当肿瘤抑制因子，miR-196a-5p 在OSCC 细胞凋亡中起关键作用，miR-361-5p表达下调与淋巴结转移和OSCC预后不良。这些发现支持miRNA 在口腔肿瘤发生和进展中的起关键作用。近期研究发现，与正常健康组织相比，OSCC 组织中miR-7-5p 的表达量明显下调。miR-7-5p 在人类几种癌症类型中异常表达，包括非小细胞肺癌、结直肠癌和食管鳞状细胞癌。然而，miR-7-5p 在人OSCC 中的潜在作用和作用机制仍有待确定。因此本实验旨在探究miR-7-5p 对OSCC 细胞增殖和凋亡的影响及可能的作用机制，研究起止时间为2018年3—10月。

1 材料与方法

1.1 材料

人正常口腔黏膜成纤维细胞株hOMF由上海艾研生物科技有限公司提供；OSCC 细胞株SCC25、Cal127 和Tca8113 由美国ATCC 细胞库提供；RPMI 1640 培养基由美国Hyclone 公司提供；胎牛血清、Lipofectamine 2000 转染试剂由美国Invitrogen公司提供；miR-7-5p模拟物（miR-7-5p mimics）及阴性对照序列（mimics Control）由广州锐博生物科技有限公司提供；Trizol 试剂、反转录试剂盒由赛默飞世尔公司提供；SYBR Primix Ex Taq 检测试剂盒由日本TaKaRa公司提供；噻唑蓝（MTT）试剂由美国Sigma 公司提供；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）细胞凋亡检测试剂盒由大连TaKaRa公司提供；RIPA 细胞裂解液、BCA 蛋白浓度检测试剂盒、蛋白发光液均由上海碧云天生物技术研究所提供；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜由美国Millipore 公司提供；双荧光素酶报告基因检测试剂盒由美国Promega 公司提供；锌指蛋白核转录因子4（KLF4）3′-UTR 野生型（KLF4-Wt）和KLF43′-UTR 突变型（KLF4-Mut）荧光素酶重组载体质粒由广州辉骏生物科技有限公司提供；KLF4 抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体由美国Abcam 公司提供；辣根过氧化物酶标记的免疫球蛋白G（IgG）由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。

1.2 细胞培养

OSCC细胞SCC25、Cal127、Tca8113及正常口腔黏膜成纤维细胞hOMF 均培养在含10%胎牛血清和1% 青霉素-链霉素双抗的RPMI 1640培养基中，置5%二氧化碳、37 ℃培养箱中进行培养。使用倒置显微镜观察细胞生长状态，待细胞铺满瓶底90% 时用胰蛋白酶消化细胞，以1∶3 比例进行传代，取处对数生长期的细胞用于后续实验。

1.3 细胞转染及分组

将OSCC细胞SCC25接种到细胞培养板中，过夜培养，待细胞融合度为50% 时，使用脂质体Lipofectamine 2000 转染试剂将miR-7-5p mimics（终浓度为50 nmol/L）及mimics Control（终浓度为50 nmol/L）分别转染至SCC25 细胞。实验分为三组：Control组（未转染的SCC25细胞）、NC组（转染mimics Control 的SCC25 细胞）、miR-7-5p 组（转染miR-7-5p mimics 的SCC25 细胞）。转染6 h 时更换新的培养液，于37 ℃培养箱继续培养。

1.4 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRTPCR）检测

分别采用Trizol 法提取OSCC 细胞SCC25、Cal127、Tca8113 及正常口腔黏膜成纤维细胞hOMF 中总RNA，提取转染48 h 后各组SCC25 细胞中总RNA，根据反转录试剂盒说明书配制反应体系，并合成第一链互补DNA（cDNA），然后使用SYBR Primix Ex Taq 检测试剂盒以cDNA 为模板，进行qRT-PCR 检测。以U6 为内参，分析细胞中miR-7-5p mRNA 相对表达量，扩增条件设置为：95 ℃5 min，95 ℃20 s，60 ℃30 s，72 ℃15 s，共设40个循环，以相对量2法进行计算。采用同样的方法分析转染48 h 后各组SCC25 细胞中KLF4 mRNA 相对表达量。

1.5 MTT 法检测

分别将转染24、48、72 h 后各组SCC25 细胞种植到96 孔板中，每组细胞在各个时间点设置3个复孔，向每孔细胞中加入浓度为5 g/L 的MTT 溶液20 μL，37 ℃继续培养4 h，取出细胞培养板，弃去上清培养液，再向细胞中加入150 μL 二甲基亚砜溶液，混匀后继续孵育30 min，使用酶标仪检测各孔细胞450 nm波长处吸光度，实验重复3次。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡率

分别收集转染48 h 后各组SCC25 细胞，约为1×10个细胞，以PBS洗涤2 次，向细胞中加入100 μL Bingding Buffer 结合缓冲液重悬细胞，向细胞悬液中加入Annexin VFITC 试剂10 μL，轻轻混匀，在室温下避光反应15 min，离心收集细胞，再加入预冷的PBS重悬细胞，再向细胞悬液中加入PI 染液10 μL，避光孵育5 min，在流式细胞仪上检测各组SCC25细胞凋亡情况。

1.7 双荧光素酶报告基因实验

TargetScan 等生物信息学预测软件预测结果显示，KLF43′-UTR 存在与miR-7-5p 靶向结合的位点，提示KLF4 可能是miR-7-5p 直接靶基因。根据预测结果分别构建KLF4-Wt载体质粒和KLF4-Mut载体质粒，该部分由广州辉骏生物科技有限公司完成。将KLF4-Wt 和KLF4-Mut 载体质粒分别与miR-7-5p mimics 或mimics Control 共转染至SCC25 细胞，每组设6个复孔，转染48 h 后，使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒分别检测萤火虫荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性，计算各组细胞相对荧光活性。

1.8 蛋白质印迹法（Western blotting）检测

收集转染48 h 后各组SCC25 细胞，加入RIPA 细胞裂解液，在冰上裂解提取细胞中总蛋白，使用BCA 检测试剂盒对蛋白样品进行定量检测，取40 μg 蛋白样品行SDS-PAGE 电泳，电转至PVDF 膜上，将膜置于5% 脱脂奶粉中封阻1 h，PBST 洗膜3 次，然后加入1∶1000 稀释的KLF4 一抗，4 ℃过夜杂交，PBST 洗膜3 次，加入1∶3000 稀释的二抗，室温杂交2 h，PBST洗膜3 次，加入ECL 发光液，显影、成像、拍照，以GAPDH 为内参条带，采用Image J 图像分析软件分析条带灰度，分别计算各组SCC25 细胞中KLF4 蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 miR-7-5p 在OSCC 细胞中表达下调

qRTPCR 结果显示，miR-7-5p 在人正常口腔黏膜成纤维细胞hOMF 及3 种不同OSCC 细胞中的表达量比较，

F

=319.810，

P

＜0.001。 与hOMF（1.00±0.09）比较，miR-7-5p 在3 种不同OSCC 细胞SCC25（0.21±0.02）、Cal127（0.43±0.04）和Tca8113（0.48±0.05）中的表达量有不同程度的下调（

P

＜0.05）。在3 种不同OSCC细胞中，SCC25细胞miR-7-5p的基础表达量最低，因此选择SCC25细胞株进行后续实验。

2.2 miR-7-5p mimics 转染效果检测

qRT-PCR 检测结果显示，Control 组、NC 组及miR-7-5p 组SCC25细胞中miR-7-5p 的表达量比较，

F

=547.999，

P

＜0.001。miR-7-5p 组（5.96±0.62）明显高于Control 组（1.00±0.11）和NC 组（0.97±0.10）（

P

＜0.05），而Control 组和NC 组相比较差异无统计学意义（

P

＞0.05）。提示过表达miR-7-5p的SCC25细胞株构建成功。

2.3 过表达miR-7-5p 抑制SCC25 细胞增殖

MTT法检测结果显示，miR-7-5p 组SCC25 细胞吸光度在48 h和72 h时低于Control组和NC组（

P

＜0.05），Control 组和NC 组SCC25 细胞在24、48、72 h 时吸光度均差异无统计学意义（

P

＞0.05）。表明miR-7-5p 过表达能够抑制SCC25细胞增殖。见表1。

表1 过表达miR-7-5p对口腔鳞状细胞癌SCC25细胞24、48、72 h时增殖吸光度的影响/±s

2.4 过表达miR-7-5p 促进SCC25细胞凋亡

流式细胞术检测结果显示，Control 组、NC 组及miR-7-5p组SCC25 细胞凋亡率比较，

F

=23.168，

P

＜0.001。miR-7-5p 组SCC25 细胞凋亡率（24.41±8.15）%明显高于Control 组（9.48±2.65）% 和NC 组（10.21±3.02）%（

P

＜0.05），而Control 组和NC 组SCC25 细胞凋亡率相比较差异无统计学意义（

P

＞0.05）。说明miR-7-5p过表达能够诱导SCC25细胞发生凋亡。

2.5 miR-7-5p 靶向调控KLF4 基因

TargetScan 等生物信息学软件预测结果显示（图1A），miR-7-5p与KLF43′-UTR存在互补配对碱基，提示KLF4可能是miR-7-5p 的直接靶基因。双荧光素酶报告基因实验分析结果表明，与NC 组（1.00±0.10）比较，KLF4-Mut载体质粒miR-7-5p mimics 转染后SCC25细胞相对荧光活性（1.00±0.11）差异无统计学意义（

t

=0.117，

P

=0.913），而KLF4-Wt 载体质粒miR-7-5p mimics 转染后SCC25 细胞相对荧光活性（0.26±0.03）降低（

t

=16.830，

P

＜0.001），提示miR-7-5p 能够靶向结合野生型KLF43′-UTR 序列。qRT-PCR 结果显示，miR-7-5p 组SCC25 细胞中KLF4 mRNA（0.33±0.03）低于NC 组（1.00±0.10）（

t

=11.115，

P

＜0.001），蛋白质印迹法检测结果（图1B）也显示其蛋白表达水平（0.42±0.04）低于NC 组（0.12±0.01）（

t

=12.603，

P

＜0.001）。 提示miR-7-5p 能够负向调控KLF4的表达。

图1 miR-7-5p靶向调节锌指蛋白核转录因子4（KLF4）：A为miR-7-5p和KLF43′非翻译区（3′-UTR）靶向结合示意图；B为蛋白质印迹法检测NC组与miR-7-5p组口腔鳞状细胞癌SCC25细胞中KLF4蛋白表达水平

3 讨论

多项研究表明miRNA 在多种癌症的生物学特征中具有十分重要的作用，如细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移。miRNA 在多种癌症中的关键作用支持其作为治疗靶标的潜在用途。近年来已经报道了多种miRNA参与OSCC的发生和发展，可作为OSCC诊断和治疗的分子标志物。miR-7-5p 属于miR-7 家族，其在多种癌症类型中表达下调，表明其在肿瘤发生和肿瘤进展中的起重要作用。据报道，miR-7-5p 在胃癌中下调并与肿瘤淋巴结转移和远处转移相关，miR-7-5p 通过调控PTEN/PI3K/AKT 信号转导通路抑制胃癌细胞侵袭和迁移。Zhu 等报道，miR-7-5p 在胰腺导管腺癌组织和细胞系中的表达显著下降，细胞功能测定表明，miR-7-5p 通过靶向SOX18 抑制PANC-1 细胞的增殖，迁移和侵袭。miR-7-5p 在肿瘤中表现出低表达，并且是关键的负调节因子。之前的研究显示，与邻近的正常组织相比，miR-7-5p 在OSCC 组织中表达下调。鉴于此，我们推测miR-7-5p 在OSCC 中也可能起到肿瘤抑制作用。然而，目前未见关于OSCC 中miR-7-5p 的表达或功能的研究。本研究初步证实了miR-7-5p 作为肿瘤抑制剂起作用，抑制OSCC 的发展。在本实验中，miR-7-5p 在OSCC 细胞系中的表达明显低于人正常口腔黏膜成纤维细胞。研究表明，miR-7-5p的过表达能够抑制OSCC 细胞增殖，诱导细胞凋亡。此外，miR-7-5p 通过直接靶向其mRNA 的3'-UTR 而负调节KLF4表达。

KLF4作为关键的转录因子，其参与调节细胞增殖、分化、迁移和凋亡，并参与正常组织稳态的发展和维持。越来越多的证据表明，KLF4在癌症进展和发展中起着抑癌或致癌基因的关键作用。目前研究显示，KLF4 在OSCC 中呈高表达，扮演致癌基因的角色。最近报道指出，miR-7-5p 介导肝细胞生长因子的活性以抑制包括KLF4 致癌基因，其抑制正常细胞（至少乳腺上皮细胞MCF-10A）发展成癌细胞。Huang 等研究发现，KLF4 可作为miR-7的靶标参与环状RNA ciRS-7调节的食管鳞状细胞癌的迁移和侵袭。microRNA-转录因子自我调节反馈环是基因表达的稳态调节的关键机制，反馈环的失调与肿瘤发生和进展紧密相关。Wei等研究发现，KLF4-miR-7 自身调节反馈环的不平衡通过削弱microRNA 加工促进前列腺癌细胞生长。以上研究表明，miR-7 可能通过调节KLF4 的表达在肿瘤中发挥作用。为了更好地理解miR-7-5p 的肿瘤抑制作用，本实验使用生物信息学软件分析并鉴定KLF4作为miR-7-5p 的靶基因。使用双荧光素酶报告基因实验测定，进一步证实KLF4 是miR-7-5p 的直接靶标。miR-7-5p 过表达伴随着OSCC 细胞中KLF4的表达下调。提示miR-7-5p 抑制SCC25 细胞增殖，诱导细胞凋亡可能与靶向调节KLF4的表达有关。

总之，miR-7-5p 在OSCC 细胞系中表达下调，并通过抑制KLF4 起到肿瘤生长抑制剂的作用。新发现的miR-7-5p/KLF4 轴提供了对OSCC 发生机制的深入了解，并为OSCC 提供了潜在的治疗靶点。本实验只在SCC25 细胞中探究miR-7-5p 靶向KLF4 基因对SCC25 细胞增殖和凋亡的影响尚显不足，后续实验将在不同细胞系及动物模型中进行证实。