清胰煎剂与颗粒中4种成分在大鼠体内的药动学比较*

欧水平，郑小翠，王森，3，陈灵，王玉和 ，任丽

(1.遵义医科大学附属医院药剂科，遵义 563000；2.遵义医科大学药学院，遵义 563003；3.毕节市第一人民医院药学实验室，毕节 551700)

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是临床常见的急腹症，发病急，进展快，死亡率高，极易发展为重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)。SAP病情凶险，常伴有局部或全身炎症反应综合征及全身多器官功能障碍[1-2]。AP的病因和发病机制是一个复杂、多因素参与的病理过程，胰酶激活和胰腺自身消化、胰腺微循环障碍等均会引起AP[3-4]。目前AP治疗主要包括中医、西医及中西医结合治疗[5]。西医治疗主要包括手术、镇痛、液体复苏等。中药治疗AP主要有中药单体、单味中药和复方。用于治疗AP的中药方剂主要有大承气汤、茵陈汤、清胰汤等[6]。清胰煎剂来源于遵义医科大学附属医院临床经验方，现已记载于《古今名方》，由大黄、赤芍、炒栀子、木香、姜厚朴、醋延胡索、丹皮及芒硝等8味药组成，组方严谨，遵循中医治疗急腹症以“通”为用的原则，诸药合用共奏疏肝理气、清热解毒、镇痛、通里攻下之功效。我院临床应用已有五十多年的历史，疗效确切，能显著提高 AP 及 SAP 的治愈率[7]。目前，清胰制剂是以煎剂应用于临床，虽然煎剂与中医辨证诊治、随症加减的原则一致，但体积大，易腐坏，携带、储存不便，制备麻烦且难以控制质量等，不适宜工业化批量生产。颗粒剂既克服了煎剂易霉变、质量难控等缺点，也保持了煎剂吸收和作用迅速的优点。笔者前期也对清胰制剂的研究概况进行了总结[7]。在前期研究的基础上，笔者采用液相色谱-串联质谱联用(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS/MS)方法研究清胰煎剂与颗粒中芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、大黄酚在大鼠体内的药动学特征，为清胰颗粒的研制和临床应用提供参考。

1 实验材料

1.1实验动物 清洁级雄性SD大鼠10只，体质量250～280 g，购自长沙市天勤生物技术有限公司，合格证号SCXK(湘)2014-0011。饲养环境温度(25±1) ℃，相对湿度( 55±2)%，每天光/暗交替 12 h/12 h。本实验经遵义医科大学动物伦理委员会批准，批准号：伦审[2017]2-083号。

1.2试药 芦荟大黄素、大黄酚(成都曼思特生物科技有限公司，批号分别为MUST-17030605，MUST-17030603，含量均>98%)，大黄素、大黄酸(中国食品药品检定研究院，批号分别为110756-201512，110757-201607，含量>98%)，1，8-二羟基蒽醌(成都埃法生物科技有限公司，批号：AF8022701)，甲醇(色谱纯，瑞典Oceanpak公司，批号：17110609G104)，清胰煎剂、清胰颗粒(遵义医科大学附属医院药剂科自制，批号分别为：201807101，2018071101)，其余试剂均为分析纯。

1.3仪器 4000Q TRAP LC/MS/MS液质联用仪(美国AB SCIEX公司)，Sartorius BT125D分析天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司，感量：0.01 mg)，TGL16M型台式高速冷冻离心机(长沙迈佳森仪器设备有限公司)，TGL-16C高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)，IKA Vortex 1涡旋仪(德国IKA 公司)，DURA12型超纯水机[泽拉布仪器科技(上海)有限公司]。

2 方法与结果

2.1清胰煎剂及清胰颗粒的制备及质量控制 遵循清胰煎剂临床水煎煮制备工艺，确定按文献[8-9]方法制备清胰煎剂浓度相当于生药量2 g· mL-1。取处方量药材，加入10倍量65 ℃水浸泡30 min(芒硝除外)，煎煮3次，每次20 min，过滤，合并3次滤液，取适量溶解芒硝，其余55 ℃减压浓缩成稠浸膏，70 ℃减压干燥得干浸膏，粉碎过筛孔内径0.18 mm(5号)筛，即得浸膏粉。按比例称取浸膏粉与辅料混匀，加入一定量浓度的乙醇，制得软材，挤压过筛制粒，干燥0.5 h，过筛孔内径2.00 mm(1号)与筛孔内径0.25 mm(4号)筛整粒即得清胰颗粒。称取清胰颗粒适量，加热水搅拌溶解，使其浓度为0.91 g· mL-1(相当于生药量2 g· mL-1)，即得清胰颗粒溶液，使用时再次搅拌均匀。课题组前期对清胰煎剂及清胰颗粒的制备工艺进行了筛选及优化，建立了质量控制方法[9]及质量标准，并考察了制剂的稳定性。研究结果表明，制备工艺合理稳定可行，建立的质量标准及质量控制方法准确、简便、重复性好，稳定性良好。

2.2对照品溶液的配制 分别精密称取芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、大黄酚、1，8-二羟基蒽醌(内标)对照品适量，加少量三氯甲烷溶解后，加入甲醇制成浓度依次为0.435，0.202，0.50，0.50，0.40 mg· mL-1的对照品溶液。分别精密吸取上述芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、大黄酚单个对照品溶液300，170，1600，480 μL于10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度得浓度分别为3.48，3.45，80.00，24.00 μg· mL-1的混合对照品溶液。加甲醇等比稀释成梯度浓度混合对照品溶液。另将内标稀释为1 μg· mL-1溶液备用。

2.3测定方法建立

2.3.1色谱/质谱条件 采用UItimate LP-C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温：25 ℃，流速：0.8 mL·min-1，0.1%甲酸溶液-甲醇(15：85)等度洗脱，进样量5 μL。采用ESI负离子检测，多反应监测(multi-reaction monitoring，MRM)模式测定。主要参数为离子化温度550 ℃；喷雾电压4500 V，气帘气压力276 kPa；雾化气压力448 kPa；辅助加热器压力448 kPa；碰撞气Medium，各成分与内标m/z、碎片能量及撞击能量见表1。

表1 4种成分及内标 MRM检测模式参数 Tab.1 Parameters for MRM detection mode of four analytes and internal standard

2.3.2样品处理 取血浆 200 μL至离心管，加入1 μg· mL-1内标溶液10 μL，涡旋1 min，加甲醇100 μL，涡旋1 min，加入盐酸溶液(0.1 mol·L-1)200 μL，涡旋1 min混匀后加7倍量乙酸乙酯，涡旋7 min，离心(5000 r·min-1，r=10 cm，5 min)，取有机层氮气吹干，加甲醇100 μL涡旋 2 min复溶，离心(12 000 r·min-1，r=10 cm，5 min)，取上清液进样分析。

2.3.3方法学考察

①专属性考察。取大鼠空白血浆、空白血浆+内标、空白血浆+混标溶液+内标，给药后血浆样品，经“2.3.2”项下方法处理后，按“2.3.1”项下方法进样测定。结果表明，空白血浆中内源性杂质均能与芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、大黄酚、内标色谱峰分开，不干扰测定。

②线性关系和定量限。取空白血浆200 μL，分别精密加入系列质量浓度的混合对照品和内标各10 μL，按样品处理方法处理，进样分析。采用加权(W=1/X2)最小二乘法，以芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚峰面积与内标峰面积的比值(Y)对浓度(X)作线性回归，结果标准曲线方程依次为Y=0.012 6X+0.006 3(r=0.994 9)，Y=0.315 0X+0.044 6(r=0.999 0)，Y=0.042 6X+0.128 0(r=0.997 1)，Y=0.062 4X-0.074 20(r=0.999 9)，Y=0.205 3X+0.006 4(r=0.999 7)，线性范围依次为5.10～652.50，1.35～172.38，31.25～4000，9.38～1200 ng· mL-1，表明各成分在各自浓度范围内线性关系良好，最低定量限依次为5.10，1.35，31.25，9.38 ng· mL-1。

③精密度与准确度实验。取大鼠空白血浆200 μL，精密加入混合对照品溶液，配制各成分低、中、高浓度的质控样品各5份，按照“2.3.2”项下的方法处理，测定3 d，代入随行标准曲线方程求得各成分浓度，计算日内、日间精密度。结果见表2，表明芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、大黄酚的日内、日间精密度RSD值均小于15%，日内、日间准确度均在±15%范围内，符合生物样本测定要求。

④回收率与基质效应实验。取空白血浆样品200 μL，精密加入混合对照品和内标溶液，制备各成分低、中、高3个浓度的质控样品各5份，经“2.3.2”项下方法处理，进样测定得峰面积为A，另取空白血浆，同法处理后，加入等量低、中、高浓度对照品和内标溶液，测定得峰面积为B，测等量未经处理的3 个浓度的工作溶液峰面积C。回收率=A/B，基质效应=B/C。结果见表2，表明芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、大黄酚4种成分提取回收率和基质效应均在 80%～110%之内，均符合标准，本方法测定条件下血浆中内源性杂质对各成分的测定没有影响。

表2 4种成分血浆样品的精密度、准确度、回收率与基质效应 Tab.2 Precision，accuracy，recovery and matrix effects of four analytes in plasma %，n=5

⑤稳定性实验。取空白血浆样品200 μL，分别精密加入混合对照品，配制成高、中、低3种浓度的样品各5份，分别于室温条件下存放24 h，-20 ℃冷冻-室温融化循环3次，-20 ℃存放2周后，按“2.3.2”项下方法处理，测定。结果表明4种成分在3种条件下测得浓度RSD值均小于15%，说明样品稳定性良好。

2.4药动学研究 雄性SD大鼠10只，给药前均禁食12 h，自由饮水，按体质量随机分为清胰煎剂组和清胰颗粒组，分别按26 g·kg-1量灌胃给“2.1”项下制备的清胰煎剂和颗粒溶液。于给药后0.083，0.25，0.5，1，2，3，4，6，8，12，24 h眼眶静脉取血1 mL，存于有肝素钠的尖底离心管中，4 ℃离心(5000 r·min-1，r=10 cm，10 min)，取血浆200 μL。按“2.3.2”项方法处理，按“2.3.1”项方法分析，计算各时间点大鼠血浆中芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、大黄酚的血药浓度。将其他成分血药浓度数据用PkSolver软件，选择非房室模型处理[10]，清胰煎剂组和颗粒组活性成分的药动学参数见表3。

表3 清胰煎剂及颗粒中 4种成分的主要药动学参数 Tab.3 Pharmacokinetic parameters of four analytes after oral administration of Qingyi decoction and granules

结果表明，清胰颗粒组芦荟大黄素、大黄素、大黄酸的达峰时间(tmax)均比煎剂组提前；大黄酚延缓25 min。颗粒组大黄素、大黄酸、芦荟大黄素Cmax略低于煎剂组；大黄酚两组基本相等。煎剂组芦荟大黄素、大黄素、大黄酚AUC0-∞比颗粒剂组稍大。采用SPSS 16.0版软件对两组主要药动学参数进行统计学分析，结果表明，清胰颗粒组4种成分所有药动学参数(tmax、t1/2、Cmax、AUC0-∞、MRT0-∞、Vz/F、CL/F)与煎剂组相比均差异无统计学意义，表明清胰颗粒剂和煎剂具有相似的药动学特征。

3 讨论

本研究对清胰制剂的君药大黄中有效成分芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、大黄酚的血药浓度进行测定，比较清胰传统煎剂与颗粒在大鼠体内的药动学特征，实验选择乙腈、甲醇沉淀蛋白，乙醚、乙酸乙酯、三氯甲烷萃取处理样品，结果发现采用萃取法处理样品，大黄酸的提取率和基质效应只有50%，采用沉淀蛋白法时芦荟大黄素、大黄素、大黄酸的提取率和基质效应比较低。大黄中蒽醌类成分主要有结合型和游离型，结合蒽醌进入体内后，经过肠道菌群代谢为游离蒽醌进而发挥作用[11]。本实验测定游离蒽醌，结果表明该方法处理样品空白血浆的干扰较小，提取回收率和基质效应均高，线性关系、精密度、稳定性良好。

本研究结果显示，清胰颗粒中4种成分主要药动学参数与煎剂比较差异无统计学意义，说明两剂型具有相似的药动学特征。两种剂型均吸收迅速，适用AP发病急、进展快的特征。总体上，煎剂AUC比颗粒剂稍大，煎剂的生物利用度稍大，颗粒血药浓度达峰时间比煎剂快，这可能由于清胰颗粒中加入了辅料，促进药物吸收，使得颗粒组的达峰时间提前。同一组不同的大鼠之间差异较大，一是由于动物自身的差异，二是由于处方中的君药大黄有泻热通便、攻积滞的功效，实验过程中发现所有大鼠均存在腹泻现象，且发生腹泻的时间与程度不一，对药物吸收产生不同程度影响。中药成分复杂，复方更是如此，且配伍后相互影响，难全面阐明中药复方的吸收、分布、代谢和排泄规律。文献[10，12]报道无论是单味大黄给药还是复方制剂给药，大黄中游离蒽醌类成分在体内吸收快，但消除较慢，大黄素、大黄酸、大黄酚和芦荟大黄素在给药后24 h可检测到。大黄酸在大鼠血浆中的浓度明显高于大黄素、芦荟大黄素和大黄酚，这可能是由于大黄酸在清胰煎剂与颗粒中含量最高，而另外3种成分含量较低，且大黄素和芦荟大黄素能在体内被氧化并转化为大黄酸[13]。番泻苷A是大黄蒽醌类衍生物以及蒽酮与葡萄糖结合形成的苷类，在体内能被β-葡萄糖苷酶代谢为蒽酮，再氧化得到其苷元大黄酸[14]。因此，这在一定程度上增加了大鼠体内大黄酸浓度，而大黄素甲醚在体内的含量较低无法检测。这些均与本实验研究结果基本一致。本研究为清胰制剂的临床应用提供了实验依据。