环介导等温扩增技术在病原微生物快速检测中的应用研究进展

刘昌亚 任晓东

（昭通卫生职业学院 云南昭通 657000）

环介导等温扩增（LAMP）技术是2000年日本学者Notomi[1]发明的一种适用于基因诊断的等温核酸扩增技术，其特点是针对靶基因的6个区段设计4种特异引物，利用链置换DNA聚合酶在等温条件（60℃～65℃左右）1h内即可完成核酸扩增反应。该技术具有以下优点：

1.特异性高。环介导等温扩增过程中有2对引物确保反应的特异性，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件（60℃～65℃左右）1h左右即可完成核酸扩增反应。而传统PCR只有一对引物，因此LAMP法扩增产物的特异性更高。

2.灵敏度高。等温扩增反应过程中不需历经温度反复变化，从而扩增酶能保持更好的活性，有助于反应的发生，这些优点有利于此方法的灵敏度提高。

3.检测时间短。整个反应时间约为1小时，比传统PCR过程要缩短近1小时，比血培养缩短至少24小时，有利于快速为患者提供服务[2]。

4.易操作和污染风险低。只需将DNA模板加入反应体系即可检测，加样后反应孔封闭，检测完成后不需要对产物进行再次分析可避免产物污染的风险。

5.成本低因为反应过程简单，故相对于RT-PCR来说对仪器性能要求没那么高，因此也降低了设备的费用，适合基层医院做出病原菌的快速诊断[2-3]。

6.技术门槛相对较低。整个操作过程中只涉及核酸提取和扩增，而这两步操作均可实现自动化操作，因此对人员的要求相对降低，也降低了此技术的门槛，有利于技术在临床的推广。

LAMP其工作原理包括三个步骤：1.起始反应物模板的合成，即先由外引物扩增出内引物扩增所需的模板，起始阶段时间很短；2.循环扩增阶段。即由内引物引导合成靶基因DNA片段。由于内引物扩增的DNA片段含有5’端DNA片段的反向互补序列，因而反向互补序列之间可通过杂交形成茎环结构，另外一条内引物与其互补链退火杂交后引导链置换合成反应，在扩增的DNA片段的另外一端产生了新的茎环结构，形成哑铃结构，如此往复循环，最后形成菜花样结构；扩增循环阶段占全面扩增时间的95%以上。

一、LAMP技术在细菌鉴定中的应用

（一）脑脊液结核分枝杆菌

结核性脑膜炎（TBM）是中枢神经系统的致命并发症[4]。治疗TBM的主要问题在于早期诊断不及时。TBM的诊断依赖于抗酸杆菌（AFB）染色和细菌培养对脑脊液结核分枝杆菌的检测，但脑脊液的AFB染色并不十分敏感。虽然TBM在培养时的敏感性优于AFB染色，但它需要3～5周的时间，因此无法提供适当的、及时的诊断[5]。Khushboo等人的研究中使用LAMP分析方法对27个脑脊液标本进行回顾性分析，并将结果与PCR检测结果进行比较。LAMP分析灵敏度为10CFU/100uL，PCR的分析灵敏度为20CFU/100uL，低于LAMP的分析灵敏度。一些低浓度细菌的样本用LAMP法检测是阳性的，但PCR检测是阴性的。进一步观察，这些实际阳性但利用PCR检测结果阴性的样本具有较低的OD值，通过患者随访进一步分析这些样本，证实它们是阳性样本。这表明，LAMP对于检测早期疾病的TBM病例灵敏度更高。

（二）沙门氏菌

沙门氏菌（Salmonella）是引起食源性疾病的主要病原菌，在我国食源性疾病中，沙门菌是最主要的致病因子之一。目前所使用的沙门氏菌分离培养、生化反应、血清学和PCR技术等检测方法在操作程序、检测时间、特异性和灵敏度方面都不理想。2019年，李阳等用LAMP对生理盐水作倍比稀释的沙门菌进行检测，检出时间为40min，最低检测限达8.7×100cfu/mL，灵敏度比PCR高100倍；对人工污染鸡蛋内容物中沙门菌的最低检测限达9.5×100cfu/mL。本实验的扩增现象只在沙门菌中发生，而在其他细菌中无扩增现象[6]。可见，LAMP是一种更快速、更灵敏、特异性更高的检测技术。

二、LAMP技术在病毒鉴定中的应用

（一）人乳头瘤病毒

高危型人乳头瘤病毒（HPV）是子宫颈癌的病原体，通过检测高危型HPV的DNA作为主要筛查工具。HPV基因型16和18是全世界最流行的基因型[7-8]。HPV基因型45在世界所有地区都非常流行，并经常在宫颈上皮内瘤变（CIN 2+）和侵袭性宫颈癌（ICC）中发现，其中2～8%的为子宫颈癌[7-8]。HPV基因型52和58在亚洲人群中普遍存在，尤其是在中国[9]。罗乐等人的研究中，使用HNB染色的LAMP法对检测高危HPV基因型16、18、45、52和58型进行检测，检测的灵敏度分别为100、10、100、10、100个拷贝/管，LAMP法只扩增了各自类型的HPV DNA，没有交叉反应，通过LAMP法检测的阳性率和PCR法基本一致。基于使用HNB染色的LAMP检测方法的简单性和成本效益，使得它更适合在临床环境中快速检测，特别是在资源有限的医院或农村诊所。

（二）丙型肝炎病毒

丙型肝炎病毒（HCV）是人类慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌发生的重要病因。HCV感染的实验室诊断主要采用酶联免疫吸附试验（ELISA）和PCR分别检测抗体和HCV-RNA[10]。HCV抗体检测是非常有效的方法，但HCV感染后，抗HCV抗体出现得较慢，所以该病毒感染早期无法用常规的免疫学方法检测出病毒抗体。PCR法检测不仅过程繁琐，而且特异性低和易交叉污染。随着LAMP技术的出现，赵娜等人利用RT-LAMP进行临床样本丙型肝炎病毒检测，RT-LAMP的特异性与灵敏度分别为100%、92.31%；而以FQ-PCR为金标准的检测方法，特异性虽为100%，但灵敏度只有69.23%[11]。RT-LAMP的假阴性率低于FQ-PCR，临床阳性标本漏检率低。

三、LAMP技术在真菌鉴定中的应用

（一）假丝酵母菌

假丝酵母菌是一类深部感染真菌，对人致病的有白假丝酵母菌、热带假丝酵母菌等，其中以白假丝酵母菌感染最为多见，可占感染的75%，白假丝酵母菌是重要的条件致病菌，占深部真菌感染的首位[12]。林江等人通过LAMP技术对实验菌株和对照菌株的研究显示：假丝酵母菌各菌种均能进行特异性的LAMP反应，灵敏度达102CFU/mL，为PCR的10倍；通过对52份临床样品分别进行培养和LAMP检测证实，LAMP方法在阳性率、灵敏度方面明显优于培养法[13]。

（二）新型隐球菌

新型隐球菌是一种条件致病菌，当机体免疫功能下降时可向全身播散，主要侵犯中枢神经系统，引起真菌性脑膜炎、脑炎、脑肉芽肿等，其中引起的脑膜炎在艾滋病患者中非常常见。李东冬等人选取引起脑膜炎最常见的11种病原菌，通过LAMP法进行特异性扩增，发现仅对新型隐球菌产生扩增，特异性好；且LAMP检测新型隐球菌的灵敏度为102/mL，与荧光PCR的最低检测线相同，敏感度高[14]。

四、LAMP技术在寄生虫鉴定中的应用

（一）隐孢子虫

隐孢子虫中最为常见的是微小隐孢子虫，引起的隐孢子虫病是一种以腹泻为主要临床表现的人畜共患原虫病。隐孢子虫是重要的机会致病性原虫，WHO于1986年将人隐孢子虫病定为艾滋病怀疑指标之一。史亚东等人利用LAPM检测微小隐孢子虫的检测限度是5×100个卵囊/uL，检测灵敏度为常规PCR的10倍[15]，特异性实验中微小隐孢子虫出现特异梯装条带，贾第虫、球虫、类圆线虫、肠阿米巴及双蒸馏水无特异梯装条带，特异性好。

（二）弓形虫

弓形虫病是由刚地弓形虫所引起的人畜共患病。它广泛寄生在人和动物的有核细胞内。弓形虫的检测过去普遍采用ELISA，但该方法特异性和灵敏度低。以PCR为基础的分子生物学检测技术虽然快速、灵敏，但假阳性高。宇芙蓉等人利用LAMP检测方法对临床100例弓形虫IgG或（和）IgM抗体阳性血液及50例阴性参考血液标本进行检测，并和PCR检测方法进行灵敏度和特异性比较。LAMP检测的灵敏度为10-8，PCR检测的灵敏度为10-6，LAMP灵敏度为PCR的100倍。在LAMP检查中100例均检测阳性，阳性率为100%，远高于PCR检测方法中74%的阳性率，且50例阴性参考血液标本阳性率为0%，具有很好的特异性[16]。

五、LAMP检测技术发展前景展望

在2000年LAMP检测技术发明以来，各个方面的研究报道逐年增加。LAMP是一种特异性强、灵敏度高、便捷快速的基因检测技术，如果对其进一步进行优化、完善，该技术必将在病原微生物诊断领域发挥极其重要的作用。若研发出碟式微流控芯片，将多种细菌的引物同时设计在该芯片上，可同时对多种细菌同时进行检测，对于临床疾病的诊断和合理的用药提供重要的依据。我们有理由相信，LAMP作为一种核酸扩增的快速检测方法，在病原体基因检测方面发挥重要作用并逐渐应用于临床。