CAR-T细胞免疫疗法在血液恶性肿瘤治疗中的研究现状

朱晶晶 林 伟综述 王建勋审校

肿瘤的细胞免疫治疗通过调动机体自身的抗肿瘤能力，达到精准靶向地清除肿瘤细胞的目的，同时避免对健康细胞产生过度的毒性，其中嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)T细胞免疫疗法以其特异性成为最具有前途的细胞免疫疗法，通过CAR基因修饰的T细胞过继移植，在血液系统恶性肿瘤的治疗中显示出了显著的疗效[1]。血液系统恶性肿瘤起源于造血细胞和淋巴细胞在不同成熟、分化阶段不受控制的生长，目前占全世界所有癌症的6.5%[2]。目前已有六款靶向CD19、一款靶向BCMA的CAR-T细胞已被批准上市[3]。CAR-T疗法成为血液恶性肿瘤治疗很有前途的手段。本文综述了目前研究比较多的靶向CD19、CD22、CD123、BCMA的特异性CAR-T及其联合的双CAR在血液恶性肿瘤治疗的研究成果及存在的问题，并对其解决方案进行展望。

1 CAR-T细胞免疫疗法

1.1 CAR的发展

CAR-T细胞与T细胞相比除了具有抗原受体(TCR)复合物外，还携带CAR部件，CAR结构决定了CAR-T的作用特异性。CAR是一种合成蛋白，目前批准的CAR-T细胞中应用的CAR结构，都是包括识别肿瘤相关抗原的胞外区和胞内活性区两大部分[4]。经过十余年发展，CAR已经发展到五代，且主要是在胞内信号区域的改变[5]。通过对胞内信号域增加共刺激分子(如CD28、4-1BB或OX40)增强T细胞的增殖及细胞因子的分泌[6]，并能在肿瘤微环境中释放促炎性因子[7]。但CAR-T在应用中仍发现很多问题，如在淋巴白血病的治疗中，CD19特异性CAR取得了巨大成功，但在治疗后CD19逃逸变异已被发现，随后靶点丢失的患者表现出疾病复发[8]。为了克服逃逸变异体的抗原靶点问题，出现了双CAR以及联合免疫检查点抗体等其他手段的治疗，这些都成为相关研究的热点。

1.2 作用机制

CAR-T疗法是将T细胞进行体外活化、基因修饰，使特异性识别肿瘤细胞表面分子的CAR表达于T细胞表面，通过CAR与肿瘤表面抗原特异性结合引起胞内信号分子活化，进一步激活T细胞发挥特异性抗肿瘤作用[9]。正常T细胞介导的细胞毒性依赖于主要组织相容性复合物(MHC)，T细胞通过信号通路发生级联反应，将T细胞活化为细胞毒T细胞(CLT)，当CLT遇到含有相同MHC-抗原肽的肿瘤细胞后，二者特异性结合，刺激CLT细胞发挥细胞毒性作用[10-11]，而CAR-T的抗原识别过程不依赖于MHC，CAR分子上的单链可变区(scFv)可直接识别并结合肿瘤细胞抗原，具有靶向特异性，是CAR-T疗法的一大优势。

2 血液恶性肿瘤的CAR-T免疫治疗

2.1 靶向CD19的CAR-T

CD19是Ⅰ型跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族，CD19在多种B细胞恶性肿瘤细胞表面上都有表达，在正常B细胞，滤泡性树突状细胞表面有表达，而在其他组织和血液细胞中无表达，被认为是CAR-T治疗B细胞肿瘤的理想靶点[12]。以CD19为靶点的CAR-T细胞是B系血液恶性肿瘤领域一种革命性的免疫治疗方法。目前抗CD19的CAR-T在B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、B细胞急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病的治疗中都取得一定成果。

在B细胞淋巴瘤的治疗中，Brudno等[13]治疗了20例B细胞淋巴瘤的Ⅰ期患者，首次在人类临床试验中表达新的抗CD19-CAR(Hu19-CD828Z)的T细胞。在试验中，55%接受治疗的患者获得完全缓解,仅5%的患者出现了严重的神经毒性。在难治性/复发性B细胞急性淋巴细胞白血病患者中，靶向CD19的CAR-T细胞可诱导83%～93%的应答率[14]。Xiao等[15]评估了人源化的CD19 CAR-T(hCART19)细胞，15例患者在hCART19输注后30 d获得了完全缓解(CR)或者CR伴血细胞不完全恢复(CRi)。180 d总生存率及无病生存率分别达到73.3%和69.2%。在另一项研究中Jia等[16]对23例R/RB-ALL患者在CAR-T治疗14天后进行评估，19例患者达到CR。以上研究虽无病例死于细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome，CRS)，但都不同程度出现不良反应，CAR-T在B-ALL的治疗中表现出高反应性和可控制的毒性。

在非霍奇金淋巴瘤(NHL)治疗中，CAR-T细胞治疗复发/难治性NHL的效果良好，FDA已经批准6种以CD19为靶标的CAR-T细胞产品[17]，其他针对NHL的CAR-T产品也在难治性NHL患者中进行测试。百时美施贵宝公司的Liso-cel已被FDA授予针对复发/难治性侵袭性NHL的突破性疗法和再生医学高级疗法的称号[18]。Abramson等[19]评估了liso-cel在269例复发/难治性大B细胞淋巴瘤患者的疗效，ORR为73%，CR率为53%，只有2%的级别≥3的CRS。

虽然抗CD19-CAR-T在部分血液肿瘤中表现出不错的疗效，但由于CD19细胞在正常B淋巴细胞上表达，使用CD19-CAR-T会造成B细胞再生障碍、感染和细胞减少等并发症，导致低丙种球蛋白血症和随后的频繁感染，这些都已被报道。此外，CAR-T细胞的增殖及持久性也是限制其疗效稳定与持久的重要因素，所以，还需要进一步探索其结构优化并联合其他手段进行干预，以提高其疗效。

2.2 靶向CD22的CAR-T

CD22作为B细胞特异性的跨膜糖蛋白表达于成熟B系细胞的细胞表面，在B细胞恶性肿瘤中广泛高表达[20]，包括慢性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤和急性淋巴细胞白血病等，但在其他组织中基本不存在，这就使CD22成为B细胞恶性肿瘤免疫治疗的理想分子靶点。

抗CD19 CAR-T细胞治疗B淋巴母细胞肿瘤(B-ALL)在目前的研究中取得了良好的临床疗效，但CD19的下调或突变是CD19-CAR-T治疗B-ALL后复发的主要原因，成为亟待解决的问题。Pan等[21]对34例患者进行了抗CD22 CAR-T细胞治疗的第一阶段试验，34例患者中70.5%达到CR/CRi。大多数患者只出现轻度CRS和神经毒性。此研究证明抗CD22 CAR-T细胞治疗可弥补B-ALL患者CD19 CAR-T细胞治疗的不足。在NHL和ALL的治疗上，靶向CD22的CAR-T产品在临床研究中，如美国国立癌症研究所的适用于滤泡性淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病的CD22 CAR产品JCAR-018正在进行临床Ⅰ期[22]。目前靶向CD22的CAR-T疗法在ALL治疗中取得一定成果，但在治疗其他B细胞肿瘤中需要更多证据，而且可以考虑联合其他靶点，以克服免疫逃逸等问题。

2.3 靶向CD123的CAR-T

白细胞介素-3受体α链(IL-3Rα)常被称为CD123，在各种血液系统恶性肿瘤中广泛高表达，包括急性髓细胞白血病(AML)、B细胞急性淋巴细胞白血病、霍奇金淋巴瘤、原发性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)等[23]。重要的是，CD123在白血病干细胞和分化程度更高的白血病细胞中都有表达，这使得CD123成为有吸引力的CAR-T治疗靶点。

CD19 CAR-T在治疗B-ALL中取得了成功，但也面临着与传统化疗相似的问题，通常表现为恶性肿瘤可以适应并克服其治疗。为改善此问题，Lulu等[24]设计了一个具有2个离散单链抗体结构域的CAR-T细胞，同时具有白血病抗原CD19和CD123的抗肿瘤活性。在体外实验中，CD19-CD123-cCAR能够独立地清除表达CD19的K562细胞和表达CD123的Jurkat细胞，证实2个结构域都具有完全的功能和独立性。在体内实验中，对小鼠的生存及肿瘤清除表现出同样的优势。CD19-CD123-cCAR代表了CAR发展的热点，其靶向机制是单CAR的复合，并对靶细胞表现出强有力的溶解能力。复合CAR比单一的CD19-CAR具有更高的缓解率和更低的复发率，有望成为癌症治疗的有力手段。

原发性浆细胞样树突状肿瘤(BPDCN)治疗后普遍预后效果差，Bole等[25]设计了CD28/4-1BB-CD123-CAR-T细胞，并证实其在体内外实验中均表现出较好的肿瘤清除能力。AML治疗后复发率为50%，CAR-T细胞已经成为治疗白血病的有力工具。Testa等[26]研究了大量AML表型情况，并发现45%的患者过度表达IL-3Rα，抗CD123 CAR-T表达细胞因子诱导杀伤性T细胞治疗成为AML的一种有前途的治疗方法[27]。Galetto等[28]在不同CAR结构的背景下筛选了多个抗原识别域，以确定对表达不同水平CD123抗原的细胞均可识别并活化的分子结构，在小鼠模型的实验中，同样表现出了显著的体内抗肿瘤活性。

CD123的独立表达特性更加使其成为血液恶性肿瘤不同阶段的潜在治疗靶点，包括初始诊断、最小残留病(MRD)和复发各阶段，但对于提高完全缓解率和降低造血毒性方面的问题仍需进一步探索。

2.4 靶向BCMA的CAR-T

B细胞成熟抗原(BCMA)也称为TNFRSF17或CD269，是肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的成员，在成熟的B淋巴细胞上高表达，在造血干细胞或非造血组织中表达较少[29]。多发性骨髓瘤(MM)中BCMA的生物学研究发现BCMA的过度表达和激活与MM的进展相关[30]，这使BCMA也成为MM有前途的CAR-T治疗靶点。

BCMA可作为MM患者的重要治疗靶点，目前蓝鸟生物的BCMA CAR-T产品bb2121已获批上市，在此之前Raje等[31]采用BCMA-4-1BB-CD3ζCAR结构制备的bb2121细胞进行治疗，对33例患者进行输注，患者客观缓解率为85%，其中15例完全缓解，16名有副反应的患者的MRD评估，结果均为阴性。抗BCMA的CAR-T治疗MM的可行性得到验证。此外，针对BCMA在未成熟浆细胞上缺乏可能会限制疗效并促进复发的问题，Liqing等[32]设计了包括scFv-BCMA和scFv-CD19串联的新型CAR(tan-CAR)，以期在MM细胞上同时靶向BCMA和CD19的表达。该CAR-T细胞在体内外对CD19和BCMA抗原阳性肿瘤细胞均有显著的抗肿瘤作用。这项研究的数据揭示了一种新的策略，不同靶向抗原的串联应用，可能有助于在CAR-T细胞治疗中降低其复发率。

综上所述，CAR-T细胞在血液恶性肿瘤的治疗中获得了不错疗效，越来越多的治疗靶点也得到开发，抗CD19、CD22、CD123、BCMA等及其联合的双CAR的开发给血液肿瘤的治疗提供了更多的选择。但整个治疗过程仍有很多问题：严重细胞毒性、细胞因子风暴、体内持久性不佳、抗原逃逸和异质性等问题。针对上述问题，需采用开发更具有特异性的胞外抗原识别受体、细胞内共刺激分子、CAR分子的联合及联合其他治疗手段等方法，来提高CAR-T细胞增殖能力、体内持久性及抗肿瘤疗效。目前，CAR-T细胞治疗后疾病复发的机制及应对策略的开发和选择是急需解决的问题。随着基因组编辑和CAR分子设计、构建手段的进步，以及联合其他手段来调节免疫系统的辅助治疗的研究，细胞免疫疗法在肿瘤治疗中的应用将进入新的发展阶段，为恶性血液肿瘤患者带来更高的治愈率并提高其生活质量。