纳布啡通过调控miR-4301/BRD4抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的机制研究

范清丽，张敏，吴楠，肖维萍

肝癌是发病率较高的恶性肿瘤，手术仍是其主要治疗方式［1］。近年来研究表明，麻醉可能与肿瘤病人术后转移复发有关［2-3］。纳布啡是一种吗啡喃类半合成激动-拮抗镇痛药，临床常用于麻醉和疼痛治疗，有研究发现纳布啡可改善术后非小细胞肺癌病人机体免疫功能［4］。微小RNA（miRNA）参与调控肿瘤细胞的恶性生物学行为过程，如微小RNA-4301（miR-4301）在肝癌组织中下调表达［5-6］。然而纳布啡和miR-4301对肝癌细胞恶性生物学行为的影响尚未清楚。因此，本研究旨在研究纳布啡是否通过调控miR-4301影肝癌细胞的恶性生物学行为。本研究时间为2019年1—7月。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂肝癌细胞株Huh7（美国ATCC）；纳布啡（宜昌人福药业有限责任公司，批号H20130128）；DMEM培养基、四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）试剂盒、蛋白裂解液（美国Sigma）；Transwell小室、基质胶（美国BD）；总RNA提取试剂盒、荧光定量试剂盒（日本TaKaRa公司）；双荧光素酶报告基因检测试剂盒（美国AAT Bioquest）；miR-4301模拟物（miR-4301）及模拟物阴性对照（miR-NC）、miR-4301抑制表达载体（anti-miR-4301）及阴性对照（anti-miRNC）、溴结构域蛋白4野生型荧光素酶载体（WTBRD4）、溴结构域蛋白4突变型荧光素酶载体（MUTBRD4）（北京源生思创生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1细胞培养处理与分组肝癌细胞株Huh7常规培养于DMEM培养基中，取对数生长期Huh7，用浓度分别为50 μmol、100 μmol、200 μmol的纳布啡处理记为不同浓度纳布啡处理组，正常培养的细胞作为对照组；将miR-NC、miR-4301分别转染至细胞Huh7中，分别记为miR-NC组、miR-4301组；将antimiR-NC、anti-miR-4301分别转染至细胞Huh7中再用200 μmol的纳布啡处理记为纳布啡+anti-miR-NC组、纳布啡+anti-miR-4301组。

1.2.2MTT检测细胞增殖抑制率各组细胞培养48 h，按试剂盒说明操作，检测各孔吸光度（OD）值，计算细胞增殖抑制率。

1.2.3Transwell检测细胞迁移和侵袭迁移实验：Transwell上室接种200 μL无血清细胞悬液，培养48 h，将多聚甲醛固以及结晶紫染色，最后用显微镜下观察并计数。侵袭实验：用基质胶包被Transwell小室的上室，然后同迁移实验操作。

1.2.4蛋白质印迹法检测蛋白表达提取各组Huh7细胞总蛋白，经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白，转膜、封闭，加入一抗（1∶1 000）4℃孵育过夜，然后加入二抗（1∶2 000）室温孵育2 h，显影，成像，分析蛋白条带的吸光度。

1.2.5实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测miR-4301和BRD4 mRNA表达水平提取各组细胞总RNA，反转录成cDNA，miR-4301和BRD4分别以U6和GAPDH为内参进行PCR，相对表达量用2-ΔΔCt法计算。

1.2.6双荧光素酶报告实验检测miR-4301和BRD4的靶向关系将BRD4野生型及突变型荧光素 酶 载 体（WT-BRD4、MUT-BRD4）分 别 与miR-4301、miR-NC共转染至Huh7细胞，按照说明书操作，检测Huh7细胞荧光素酶活性。

1.3 统计学方法采用SPSS 20.00进行统计学分析。计量资料以±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，多组之间的两两比较采用SNK-q检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 纳布啡对肝癌Huh7细胞增殖、迁移侵袭的影响与对照组相比，不同浓度纳布啡处理可提高Huh7细胞抑制率和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A（p21）表达水平，降低迁移、侵袭细胞数，降低细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、基质金属蛋白酶2（MMP-2）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）的表达水平，且呈浓度依赖性（P＜0.05），见图1，表1。

表1 纳布啡对肝癌Huh7细胞增殖、迁移侵袭的影响∕±s

表1 纳布啡对肝癌Huh7细胞增殖、迁移侵袭的影响∕±s

注：Cyclin D1为细胞周期蛋白D1，p21为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A，MMP-2为基质金属蛋白酶2，MMP-9为基质金属蛋白酶9。①与对照组比较，P＜0.05。②与纳布啡50 μmol组比较，P＜0.05。③与纳布啡100 μmol组比较，P＜0.05。

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图1 肝癌Huh7细胞增殖、迁移侵袭相关蛋白的表达

2.2 纳布啡对肝癌Huh7细胞中miR-4301/BRD4表达的影响与对照组相比，不同浓度纳布啡组miR-4301表达水平升高，BRD4 mRNA和蛋白表达水平降低，且呈浓度依赖性（P＜0.05），见图2，表2。

图2 肝癌Huh7细胞BRD4蛋白的表达

表2 纳布啡对肝癌Huh7细胞miR-4301∕BRD4表达的影响∕±s

表2 纳布啡对肝癌Huh7细胞miR-4301∕BRD4表达的影响∕±s

注：miR-4301为微小RNA-4301，BRD4 mRNA为溴结构域蛋白4信使RNA，BRD4为溴结构域蛋白4。①与对照组比较，P＜0.05。②与纳布啡50 μmol组比较，P＜0.05。③与纳布啡100 μmol组比较，P＜0.05。

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2.3 miR-4301靶向调控BRD4的表达Starbase预测发现BRD4与miR-4301有结合位点。miR-4301与WTBRD4共转染的细胞Huh7荧光素酶活性显著降低（P＜0.05）；而miR-4301与MUT-BRD4共转染的细胞Huh7的荧光素酶活性差异不显著。miR-4301组BRD4表达水平低于miR-NC组（0.22±0.02）比（0.57±0.05）；antimiR-4301组BRD4表达 水平 高于anti-miR-NC组（0.96±0.08）比（0.55±0.04）（P＜0.05），见图3，表3。

表3 肝癌Huh7细胞双荧光素酶报告实验∕±s

表3 肝癌Huh7细胞双荧光素酶报告实验∕±s

注：miR-NC组为miR-4301模拟物阴性对照，miR-4301为miR-4301模拟物，WT-BRD4为BRD4野生型荧光素酶载体，MUT-BRD4为BRD4突变型荧光素酶载体。

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图3 miR-4301靶向调控肝癌Huh7细胞BRD4的表达：A为BRD4的3’UTR中含有与miR-4301互补的核苷酸序列；B为BRD4蛋白的表达

2.4 miR-4301过表达对肝癌Huh7细胞增殖、迁移侵袭的影响与miR-NC组相比，过表达miR-4301可降低BRD4表达水平，提高细胞抑制率和p21表达水平，降低Huh7细胞迁移和侵袭数，降低增殖相关蛋白CyclinD1以及迁移侵袭相关蛋白MMP-2和MMP-9的表达水平（P＜0.05），见图4，表4。

表4 miR-4301过表达对Huh7细胞增殖、迁移侵袭的影响∕±s

表4 miR-4301过表达对Huh7细胞增殖、迁移侵袭的影响∕±s

注：BRD4为溴结构域蛋白4，Cyclin D1为细胞周期蛋白D1，p21为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A，MMP-2为基质金属蛋白酶2，MMP-9为基质金属蛋白酶9，miR-4301为miR-4301模拟物，miR-NC为miR-4301模拟物阴性对照。

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图4 溴结构域蛋白4（BRD4）和增殖、迁移侵袭相关蛋白的表达

2.5 抑制miR-4301表达逆转了纳布啡（200μmol）对肝癌Huh7细胞增殖、迁移侵袭的作用与纳布啡+anti-miR-NC组相比，纳布啡+anti-miR-4301可提高BRD4表达水平升高，降低细胞抑制率及p21表达水平，增加细胞迁移和侵袭数，提高增殖向蛋白CyclinD1以及迁移侵袭相关蛋白MMP-2和MMP-9的表达水平（P＜0.05），见图5，表5。

表5 抑制miR-4301表达逆转了纳布啡对肝癌Huh7细胞增殖、迁移侵袭的作用∕±s

表5 抑制miR-4301表达逆转了纳布啡对肝癌Huh7细胞增殖、迁移侵袭的作用∕±s

注：anti-miR-4301为miR-4301抑制表达载体，anti-miR-NC为miR-4301抑制表达载体阴性对照，miR-4301为微小RNA-4301，BRD4为溴结构域蛋白4，Cyclin D1为细胞周期蛋白D1，p21为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A，MMP-2为基质金属蛋白酶2，MMP-9为基质金属蛋白酶9。①与对照组比较，P＜0.05。②与纳布啡+anti-miR-NC组比较，P＜0.05。

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图5 溴结构域蛋白4（BRD4）和增殖、迁移侵袭相关蛋白的表达

3 讨论

近年来，麻醉药除了其本身具有麻醉作用外，还影响肿瘤病人的复发、转移与预后等［7-8］。纳布啡是一种临床麻醉镇痛药，有研究报道纳布啡可抑制乳腺癌细胞的生长［9］，说明纳布啡具有抑癌作用。为研究纳布啡是否对肝癌起作用，本研究用不同浓度纳布啡处理肝癌细胞Huh7，结果显示，不同浓度纳布啡处理后，Huh7细胞抑制率逐渐升高，迁移和侵袭细胞数逐渐减少，说明纳布啡可能呈浓度依赖性抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

miRNA在肝癌的细胞增殖及凋亡中发挥着重要作用，miRNA可能通过不同的作用靶点及分子通路来促进或抑制肝癌的复发及转移［10-11］。有研究表明miR-4301可抑制乳腺癌细胞增殖并诱导细胞凋亡［12］，miR-4301高表达可抑制非小细胞肺癌细胞增殖并诱导细胞凋亡［13］，过表达miR-4301可抑制鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭［14］。以上研究均表明miR-4301具有抑癌作用，但其对肝癌细胞的影响还尚不清楚。本研究将miR-4301过表达质粒转染至肝癌细胞Huh7中，结果显示，miR-4301过表达可提高细胞抑制率，降低迁移和侵袭细胞数；说明miR-4301过表达可抑制肝癌Huh7细胞增殖、迁移和侵袭。此外，本研究还发现纳布啡处理的肝癌细胞Huh7中miR-4301表达水平显著升高，为研究纳布啡对肝癌细胞的影响是否与miR-4301有关，将miR-4301抑制表达质粒转染至肝癌细胞Huh7中的同时用纳布啡处理，结果显示，抑制miR-4301表达逆转了纳布啡对肝癌Huh7细胞的作用。

研究表明溴结构域蛋白4（BRD4）在多种肿瘤中高表达，参与肿瘤的进展过程，其抑制剂应用均显现出良好的抗肿瘤作用［15］。研究报道BRD4在肝癌细胞中高表达，显著促进了肝癌细胞的增殖，其抑制剂可抑制肝癌细胞的增殖，并诱导肝癌细胞发生凋亡［16］。有研究报道高表达BRD4的肝癌病人预后较差，抑制BRD4表达可抑制肝癌细胞增殖，促进肝癌细胞凋亡［17］，表明BRD4与肝癌的发生发展相关。同时，还有研究报道BRD4抑制剂可抑制唾液腺样囊性癌的细胞生长，迁移和侵袭［18］，说明BRD4还与癌细胞的迁移、侵袭有关。而研究显示miR-608通过靶向BRD4抑制人肝癌细胞的增殖［19］，表明miRNA可通过调控BRD4的表达影响癌细胞的生长。在本研究中，miR-4301可靶向调控BRD4的表达，且纳布啡可提高miR-4301表达水平，降低BRD4的表达水平，提示纳布啡可能通过上调miR-4301进而下调BRD4。

综上所述，纳布啡可能通调控miR-4301∕BRD4轴抑制肝癌Huh7细胞增殖、迁移和侵袭。