和厚朴酚通过miR-155 靶向Smad3 抑制高糖诱导肾小球系膜细胞凋亡的机制

余婷 高原小雪 谢宇端 胡玉海 田佩孚

（1 武汉市精神卫生中心检验科,湖北 武汉 430012;2 中国中医科学院望京医院检验科;3 武汉市汉口医院检验科）

糖尿病肾病（DN）是糖尿病最普遍的并发症之一，大约影响40%的1 型和2 型糖尿病患者，晚期通常导致慢性肾衰竭〔1〕。高血糖引发导致肾小球系膜细胞（GMC）凋亡和缺失是DN 病理进展的关键因素〔2〕。和厚朴酚（honokiol）是一种小分子多酚类物质，源自木兰属植物，在临床前模型中已被证实具有抗炎、抗血管生成和抗肿瘤活性〔3〕。研究发现，和厚朴酚可以作为人结直肠癌的潜在新型化疗药物〔4〕，对体外大鼠肾小球系膜增生具有潜在的治疗作用〔5〕。研究表明，miR-155 广泛参与机体造血细胞的发育和分化，免疫细胞的发育分化、炎症反应、免疫应答等生物过程，并且在肝癌、乳腺癌、胰腺癌等多种癌组织或细胞株中表达上调，与肿瘤的侵袭、转移密切相关〔6〕。miR-155 在DN 肾组织和高糖刺激的肾实质细胞中高表达〔7〕。Smad3 属于Smad 蛋白家族，参与胚胎发育、骨骼和器官形成，其水平在癌症和肝肾损伤的组织中异常表达〔8，11〕。但是和厚朴酚、miR-155 和Smad3 在高糖损伤的小鼠肾小球系膜细胞（MGMC）中的作用与联系尚未可知。本研究建立高糖诱导的MGMC 凋亡模型，检测和厚朴酚抑制高糖诱导的MGMC 凋亡的作用机制，并探寻Smad3 和miR-155 在和厚朴酚对减轻糖尿病肾损伤过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 MGMC（SV40-MES-13；购自美国ATCC）；和厚朴酚（≥98%；购自美国Sigma-Aldrich 公司）；抗Smad3 抗体和抗β-actin 抗体（购自美国Abcam公司）；Lipofectamine 2000 总RNA 提取试剂盒（购自美国Invitrogen 公司）、反转录试剂盒、real-time PCR 试剂盒、BCA 蛋白检测试剂盒（购自美国Thermo）；膜联蛋白V（Annexin V）/碘化丙啶（PI）细胞凋亡检测流式法细胞凋亡检测试剂盒（购自美国BD 公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将SV40-MES-13 细胞培养于DMEM 培养基（含10%胎牛血清、1% 青-链霉素）中和37℃、5% CO2、95%湿度的培养箱中。

实验分组:空白组、高糖组、高糖+和厚朴酚组。其中，空白组含5 mmol/L D-葡萄糖；高糖组含30 mmol/L D-葡萄糖；高 糖+和厚朴 酚组含30 mmol/L D-葡萄糖+40 μg/ml 和厚朴酚。

1.2.2 细胞转染 在6 孔板中接种SV40-MES-13细胞（2×105个/孔）。待SV40-MES-13 细胞基本融合为一层时，遵循Lipofectamine 2000 试剂操作指南，用无血清DMEM 稀释miR-con、miR-155、si-con、si-Smad3、anti-miR-con、anti-miR-155、野生型（WT）-Smad3+miR-con、WT-Smad3+miR-155、突变型（MUT）-Smad3+miR-con 和MUT-Smad3+miR-155、anti-miR-155+si-con、anti-miR-155+si-Smad3 等载体，取等体积Lipofectamine 2000 与各组载体充分混合20 min，将其加至SV40-MES-13 细胞中，6 h 后更换为完全DMEM，继续转染48 h，收获SV40-MES-13 细胞。

1.2.3 Real-time PCR 检测miR-155 和Smad3 mRNA 的表达 收集各组SV40-MES-13 细胞，提取总RNA，按照16℃30 min、42℃30 min、82℃5 min 的反应程序合成cDNA，获得的cDNA 于4℃放置10 min，保存在-80℃。取cDNA 按照real-time PCR试剂盒的操作规程说明，按照95℃ 5 min；95℃15 s、60℃30 s、72℃40 s，40 个循环；72℃10 min的反应程序进行PCR。引物序列:miR-155 上游引物5＇-TTAATGCTAATCGTGATAGG-3＇，下游引物为试剂盒内通用引物；Smad3 上游5＇-GAGAGGTGTGCGGCTCTACT-3＇，下游5＇-CTGGTTGCAGTTGGGAGACT-3＇；内参照β-actin 上游5＇-CATTGCTGACAGGATGCAGA-3＇，下 游5＇-CTGCTGGAAGGTGGACAGTGA-3＇。miR-155 和Smad3 mRNA 的表达数据通过在Bio-Rad PCR 系统中进行分析。

1.2.4 流式细胞术测定细胞凋亡率 SV40-MES-13 细胞经 高糖和（或）和厚朴酚（20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L）处理后，接种至6 孔板（2×104个/孔），培养72 h后收集细胞，按照Annexin V/PI试剂盒操作指南，室温黑暗条件下将细胞与5 μl Annexin V-FITC 和5 μl PI 混匀，20 min，后于在流式细胞仪进行测定凋亡率（%）检测。

1.2.5 Western 印迹检测Smad3 蛋白表达 将培养48 h 的各组SV40-MES-13 细胞（空白组、高糖组、试验组）以RIPA 裂解液提取蛋白，经BCA 法试剂测量其浓度。蛋白进行十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和转膜，封闭2 h，后4℃加入抗Smad3 和抗β-actin（内参照）一抗，4℃孵育保持12 h，室温下加入稀释的二抗，孵育2 h 后，分析Smad3 蛋白水平。

1.2.6 双萤光素酶报告系统实验 将SV40-MES-13 细胞接种于24 孔板（1×104个/孔），培养至80%～90%融合。构建miR-155 结合位点的Smad3双荧光素酶报告载体WT-Smad3 和MUT-Smad3，然后分别在SV40-MES-13 细胞中共转染miR-con 或miR-155。48 h 后，在室温下将SV40-MES-13 细胞与裂解液反应20 min，加入荧光素酶底物测量荧光素酶活性。分析萤火虫相对于海肾的荧光素酶活性。

1.3 统计学处理 采用SPSS21.0 软件进行单因素方差分析和t检验。

2 结果

2.1 不同浓度的和厚朴酚对高糖诱导MGMC 凋亡的影响 流式细胞术结果显示，与空白组〔（8.59±0.96）%〕相比，高糖组的细胞凋亡率〔（32.64±2.76）%〕显著上升（P＜0.05）；与高糖组相比，高糖+和厚朴 酚20 μmol/L 组、高 糖+和厚朴 酚40 μmol/L组、高糖+和厚朴酚80 μmol/L 组的细胞凋亡率均显著下降〔（24.55±3.05）%、（15.38±2.37）%、（18.26±2.18）%；P＜0.05〕；与高糖+和厚朴酚20 μmol/L组相比，高糖+和厚朴酚40 μmol/L组细胞凋亡率减少且差异显著（P＜0.05）。说明和厚朴酚可以抑制高糖诱导的MGMC 凋亡，根据实验结果，40 μmol/L 和厚朴酚抑制细胞凋亡效果最佳，选择和厚朴酚40 μmol/L 用于后续实验。

2.2 和厚朴酚对高糖诱导的MGMC 中miR-155 和Smad3 表达的影响 qRT-PCR 和Western 印迹结果显示（图1 和表1），与空白组相比，高糖组的MGMC中miR-155 表达量显著减少（P＜0.05），Smad3 mRNA 和Smad3 蛋白表达量显著增加（P＜0.05）；与高糖组相比，高糖组+和厚朴酚组的MGMC 细胞中miR-155 表达量比高糖组增加（P＜0.05），Smad3 mRNA 和Smad3 蛋白表达量显著减少（P＜0.05）。

图1 检测肾小球系膜细胞Smad3 蛋白的表达

表1 和厚朴酚对高糖诱导MGMC 中miR-155 和Smad3 表达的影响(,n=3)

表1 和厚朴酚对高糖诱导MGMC 中miR-155 和Smad3 表达的影响(,n=3)

与空白组相比较:1）P＜0.05；与高糖组相比较:2）P＜0.05

2.3 过表达miR-155 抑制高糖诱导的MGMC 细胞凋亡 qRT-PCR 和流式细胞术结果表明（表2），与高糖+miR-con 组相比，高糖+miR-155 组的MGMC中miR-155 表达量显著增加（P＜0.05），而MGMC细胞凋亡率显著减少（P＜0.05）。

表2 过表达miR-155 对高糖诱导肾小球系膜细胞凋亡的影响(,n=3)

表2 过表达miR-155 对高糖诱导肾小球系膜细胞凋亡的影响(,n=3)

2.4 miR-155 靶向调控Smad3 的表达 Targetscan软件预测结果显示（图2A），miR-155 靶向Smad3 的3＇UTR。双荧光素酶报告系统结果显示（表3），miR-155 组WT-Smad3 的萤火虫荧光素酶相对活性比miR-con 组显著下降（P＜0.05），而miR-155 组、miRcon 组MUT-Smad3 的萤火虫荧光素酶相对活性无明显变化（P＞0.05）。Western 印迹结果发现（图2B），miR-155 组的Smad3 蛋白表达量（0.18±0.05）比miRcon 组（0.59±0.06）显著下降（P＜0.05）；anti-miR-155组的Smad3 蛋白表达量（1.35±0.11）比anti-miR-con组（0.54±0.05）显著上升（P＜0.05）。

图2 miR-155 靶向Smad3 mRNA 的3′UTR 调控其表达

表3 miR-155 与Smad3 的双荧光素酶报告实验(,n=3)

表3 miR-155 与Smad3 的双荧光素酶报告实验(,n=3)

2.5 沉默Smad3 抑制高糖诱导的MGMC 凋亡 高糖组+si-Smad3 组的MGMC 中Smad3 mRNA 和蛋白表达量比高糖+si-con 组显著下降（P＜0.05），细胞凋亡率也比高糖+si-con 组显著下降（P＜0.05）。见图3、表4。

图3 检测肾小球系膜细胞Smad3 蛋白表达

表4 沉默Smad3 抑制高糖诱导的MGMC 凋亡(,n=3)

表4 沉默Smad3 抑制高糖诱导的MGMC 凋亡(,n=3)

2.6 和厚朴酚通过miR-155 靶向Smad3 表达影响调节高糖诱导的MGMC 凋亡 与高糖+和厚朴酚+anti-miR-con 组相比，高糖+和厚朴酚+anti-miR-155组的Smad3 mRNA、蛋白表达量和细胞凋亡率均显著上升（P＜0.05）；与高糖+和厚朴酚+anti-miR-155+si-con 组相比，高糖+和厚朴酚+anti-miR-155+si-Smad3 组Smad3 mRNA、蛋白表达量和细胞凋亡率均显著下降（P＜0.05）。见图4，表5。

图4 检测肾小球系膜细胞Smad3 蛋白表达

表5 和厚朴酚通过miR-155 靶向Smad3 调节抑制高糖诱导的MGMC 凋亡(,n=3)

表5 和厚朴酚通过miR-155 靶向Smad3 调节抑制高糖诱导的MGMC 凋亡(,n=3)

与高糖+和厚朴酚+anti-miR-con 组相比较:1）P＜0.05；与高糖+和厚朴酚+anti-miR-155+si-con 组相比较:2）P＜0.05

3 讨论

2013 年，我国糖尿病患病率已超过10%，而糖尿病引发的并发症已成为威胁患者健康和生命的重大问题〔12，13〕。糖尿病并发症通常引发DN，通常伴有系膜细胞功能障碍高血糖可造成GMC 脱落和凋亡〔14，15〕。因此，探索高糖诱导GMC 凋亡过程的潜在分子机制，是DN 的研究热点。

和厚朴酚是玉兰科中药中的一种多酚类活性成分，具有抗炎、抗血管增生的作用，能够减轻促纤维化和促炎症因子及细胞外基质蛋白的表达，成为预防肾纤维化的治疗药物〔16〕。研究表明，在内毒素刺激的人GMC 模型中，和厚朴酚通过抑制炎性因子水平，有效保护肾损伤〔17〕。在肾脏缺血再灌注损伤中，和厚朴酚通过减轻氧化应激、炎症反应和抑制凋亡进而改善肾脏损伤〔18〕。本研究中，高糖诱导的MGMC 凋亡可被不同浓度的和厚朴酚所抑制，证实和厚朴酚对DN 具有潜在的临床抑制作用。

miR-155 是miRNA 家族中典型的多功能miRNA，miR-155 参与造血、免疫、炎症和肿瘤形成和发展等生物过程，与细胞增殖、凋亡等密切相关〔19〕。Gao 等〔20〕在透明细胞肾细胞癌中检测到高水平的miR-155，发现其促进透明细胞肾细胞癌的增殖和侵袭。Beltrami 等〔21〕研究发现，miR-155 在DN 患者尿液标本、肾小球中表达丰富。本研究表明，和厚朴酚促进高糖诱导的MGMC 中miR-155 的表达；过表达miR-155 抑制高糖促MGMC 凋亡的效果，下调miR-155 可逆转和厚朴酚对高糖诱导肾小球系膜细胞凋亡的抑制作用，说明在高糖诱导的MGMC 中，和厚朴酚通过上调miR-155 的表达，减轻MGMC 凋亡。

已知Smad3 是多种生物过程的重要参与者，如细胞凋亡、增殖、干细胞分化、胚胎发育等，它介导TGF-β 的促纤维化活性〔22〕。资料显示，Smad3 磷酸化水平在暴露于高糖的足细胞中增强，低表达Smad3 可拮抗高糖刺激的足细胞凋亡〔23〕。本研究结果与上述结果类似，即高糖使MGMC 中的Smad3表达上调，沉默Smad3 能减轻高糖诱导的MGMC 凋亡。另外，高糖导致的Smad3 高表达被和厚朴酚所抑制，说明和厚朴酚抑制MGMC 凋亡与抑制Smad3有关。本研究中，Targetscan 软件、双荧光素酶报告系统结合Western 印迹实验预测证实出miR-155 与Smad3 的3＇UTR 部分互补配对。双荧光素酶报告系统进一步证实miR-155 对Smad3 的调控功能，并说明在高糖诱导的MGMC 中，和厚朴酚对高糖损伤MGMC 凋亡的抑制作用是通过miR-155 靶向Smad3从而抑制细胞凋亡；体现了miR-155 对Smad3 的调控功能。

本研究首次阐述了和厚朴酚高糖诱导的MGMC细胞中通过上调miR-155 靶向Smad3，抑制减轻高糖诱导的MGMC 细胞凋亡，揭示了和厚朴酚在治疗DN 中的重要临床意义。