针灸实验中非麻醉状态下鼠科动物固定方法应用国内外进展

姜珊,蒋广威,尹磊淼,2,徐玉东,2,陈艳焦,2,杨永清,2,王宇,2

（1.上海中医药大学,上海 201203;2.上海市针灸经络研究所,上海 200030）

针灸实验研究多以鼠科动物为实验对象,为便于针灸操作,多采用在非麻醉状态下固定实验动物。目前针灸研究中采用的动物固定方法包括束缚固定[1]、置高台固定[2]、悬吊固定[3]。以上固定方法分别与束缚应激（捆绑）、恐高应激（置高台）和失重应激（悬吊）相关。因不同固定方法均会产生不同程度的应激反应,影响实验动物生理、病理指标,从而影响针灸疗效的准确评估。笔者通过分析国内外针灸实验中不同固定方法对针灸效应的干预,为选择恰当的动物固定方法提供建议,以达到对针灸效应最小干预的目的,现报道如下。

1 固定应激及其对动物生理、病理的影响

1.1 应激

应激是机体在受到各种强烈刺激时所产生的全身性的非特异适应性综合反应,表现为交感神经-肾上腺髓质（sympathetic-adrenomedullar, SSA）系统和下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴（hypothalamo-pituitaryadrenocortical, HPA）系统的活化,并伴有多系统组织和器官功能紊乱[4]。针刺效应与SSA和HPA系统密切相关,可有效干预中枢和外周HPA的各环节,可明显降低 HPA轴相关激素促肾上腺皮质激素（adrenocorticotropic hormone, ACTH）、皮质醇（corticosterone, CORT）、促肾上腺皮质激素释放激素（corticotropin-releasing hormone, CRH）水平[5-6]。因此,应激效应与针刺效应叠加,将影响对针刺效应的准确评判。

1.2 导致应激的外部因素

应激源作用于机体产生应激[7]。动物固定是针灸实验研究中诱发实验动物应激的主要应激源之一,包括捆绑束缚固定[1]、固定器束缚固定[8-9]、网罩束缚固定[10]、徒手固定[11]、悬吊固定[3]以及置高台固定[12]等。

其中捆绑束缚固定、固定器束缚固定、网罩束缚固定、徒手固定属于外力固定,可产生不同程度的束缚应激;置高台固定产生恐高应激;悬吊固定产生失重应激。

1.3 应激对机体的影响

在应激状态下,机体的多种稳态平衡被打破[13]。因应激程度、方式不同,可使机体产生生理性应激反应和病理性应激反应,即良性反应（适度应激）和不良反应（过度应激）。

研究表明束缚应激的实施时间与应激强度相关。单次刺激时间、频率、强度所致累积刺激量决定应激程度。实验研究中,慢性应激多见单次刺激0.5～6 h[14-16],反复刺激7～24 d[15-17];制备急性应激模型多见单次刺激 3～6 h,重复 1～5 d[18-20]。提示即使采取强刺激,但时程小,也不会对动物产生较大生理影响。对应激程度的评价指标可分为短效指标、长效指标和疾病指标。

1.3.1 束缚应激对机体的影响

束缚应激对机体产生较大干预。其中捆绑束缚、徒手固定对机体的影响最大,固定器固定、网罩束缚次之。捆绑束缚[21]通过绳索固定四肢、躯干,使动物处于强迫体位,活动度小,反抗激烈,应激反应大;固定器束缚可以调节肢体活动部位到合适位置,多采用鼠套[22]、布袋[23]等网罩类束缚方法,可使鼠类处于较自然状态,可减小动物强烈反抗程度,应激相对较小[24]。

目前针灸实验研究多采用捆绑束缚固定方法。研究提示,捆绑束缚固定应激可诱发鼠科整体行为认知、内分泌系统、自主神经系统生理指标改变,以及消化系统器质性病变。单次6 h、重复7～21 d慢性捆绑束缚固定应激可使鼠类出现焦虑样行为、体质量增长减慢;慢性不可预测捆绑束缚性应激则会使鼠类患抑郁症[15],糖皮质激素及其受体表达增加[25]。单次 2～4 h长期捆绑束缚应激,可激活HPA轴和自主神经系统[26]。单次6 h捆绑束缚冷应激可致鼠类患急性胃溃疡性疾病[20,27]。

固定器束缚应激会造成鼠科整体行为认知、内分泌系统、神经系统的生理病理改变及心血管系统和消化系统的器质性病变。研究表明,单次 2.5 h、重复7～14 d固定器束缚应激,可致鼠类认知障碍和海马神经元树突棘缺失[17]。单次0.5 h、9 d的固定器束缚固定,会造成大鼠体质量增幅、痛阈和应激效应相关激素含量明显降低,激活HPA轴,产生慢性应激效应[14]。固定器束缚应激可致大鼠肝脏中过氧化物酶体增殖物激活型受体α（PPAR-α）及其靶基因肝型肉碱棕榈酰转移酶-I（L-CPT-I）mRNA 表达增加,但研究表明 PPAR α及其 L-CPT-I表达的影响与固定器束缚应激本身有关,与应激时间长短关系不明显[28]。单次 6 h、1～21 d固定器束缚应激可导致脑源性神经营养因子 mRNA总量和第四外显子水平下降[29]。单次6 h、24 d固定器束缚应激,降低乙酰胆碱（acetylcholine, ACh）引起心血管疾病[16,30],发病率随应激增加而升高[28]。固定器束缚应激0.2～1 h会增加机体体温以及CORT水平[31];单次3 h、5 d的固定器束缚应激,使HPA轴激活,胃酸、胃酶分泌增多,产生胃溃疡疾病[19,32]。

单次6 h分别实施1 d、2 d、3 d网罩束缚,会诱发鼠科内分泌系统指标改变[18]。未见网罩束缚应激导致鼠科器质性病变的报道。

1.3.2 置高台应激对机体的影响

实验研究中,利用鼠科的畏高特性,可制备置高台应激模型[33-34]。单次30 min置高台应激时鼠科会表现出勃起、长达10 min的静止不动、排便、排尿等行为性“冻结”[35]。研究发现,单次30 min的置高台应激可以损伤鼠科空间参考记忆提取能力[36]。但置高台应激可降低鼠科糖尿病模型血糖水平[2]。置高台应激对鼠科的生理、病理有一定影响,但未见器质性病变报道。

1.3.3 悬吊应激对机体的影响

悬吊应激会造成鼠科消化系统器质性病变、整体行为认知、内分泌系统和神经系统等生理、病理改变。单次6 h悬吊应激状态中鼠类体温逐渐下降,悬吊加束缚应激还可导致胃溃疡[37]。重复应激使动物逐渐产生对应激的适应能力,减缓体温下降。悬吊应激使鼠类性行为周期改变、学习记忆能力降低[38]。

不同固定方式对鼠科基础生理指标、行为学及各系统的影响见表1。

表1 不同固定方式对鼠科基础生理指标、行为学及各系统的影响

2 固定应激对针灸效应的干预

2.1 束缚固定

针灸实验研究中,捆绑束缚[21]的松紧度很难控制;固定器和网罩类束缚方法,虽可以使鼠类处于俯卧自然状态,但鼠类均处于强迫体位。针刺时,动物因疼痛发生挣扎,导致体位改变,取穴不准,针刺深度也很难把握,甚至挣脱而咬伤实验人员,如太紧则易导致动物肢体缺血坏死[39]。

研究表明,针灸实验中采用束缚固定可使鼠类出现毛色暗淡无光,精神紧张状态、萎靡、焦躁,食欲减退,甚至出现呕吐、便溏现象等不良应激反应[40]和降低糖尿病模型血糖水平的良性应激反应[2]。但束缚和针刺均能明显降低糖尿病模型的血糖水平,束缚应激效应显著,在此效应叠加基础上难以准确评估针刺效应[2]。也有研究表明,用特殊束缚装置对鼠类进行固定30 min不会影响鼠科的体质量和学习记忆能力及视力,束缚本身没有使被固定的鼠类产生应激反应影响实验结果[41]。

单次束缚应激0.5～6 h,总时长1～24 d,均产生不同程度的应激反应。在针灸动物实验中,固定时间多为 30 min,刺激时间短,可使动物产生适应性,减小应激不良反应。

束缚固定应激中超过一定程度可产生强应激,引起生理、病理改变,对针灸效应产生影响。因此在针灸机制研究中,尽量避免采用束缚固定方法。如果采用束缚固定方法,固定时间尽量维持在30 min以内。

2.2 置高台固定

在针灸实验研究中,置高台固定法能有效地减少束缚应激对动物模型与针刺效应的影响。有研究[2]表明,在置高台情况下,去除置高台的本底效应,针刺仍然对糖尿病大鼠血糖有明显下调作用,针刺的效应可得到明显体现。采取置高台固定时,动物处于俯卧位的自然体位,因此该方法适用于针灸实验中动物的头背部、四肢外部的针灸治疗。

为了减小动物因置高台产生的应激反应,正式实验前可做2～5次适应性训练。置高台固定产生较小应激,对生理、病理影响较小,对针刺效应的干预也较小,因此在针灸机制研究中,推荐采用置高台固定方法。

3 应激评价方法在针灸研究中的应用

不同种类、程度的应激对动物的影响存在差异,并与动物状态（疾病模型）密切相关。因此,在针刺研究中,要根据动物状态（疾病模型）、穴位等实验条件,依据应激评价,选用合适的固定方法。在针灸实验研究中,应激的评价方法主要包括行为学评价、基本生理指标检测、实验室指标评价等。

行为学评价方法包括动物整体状态评价[42]、强迫游泳实验[42-43]、旷场实验[43]、水迷宫实验[44]、蔗糖摄取实验[45]等。其中动物整体状态评价方法更适合于针灸研究领域。应激使大鼠产生明显的行为变化,如排便、站立不动、尖叫、发出超声波、不断的趟泪,皮毛和面部不洁、毛须树立、长期不动等[42]。应激大鼠眼周偶尔有粉红色分泌物。急性应激可导致动物行为活动增加,而慢性应激可导致行为活动减少,动物随应激时程延长,其行为表现为由兴奋状态转变为抑制状态。

实验室指标主要包括肾上腺糖皮质激素、儿茶酚胺和CORT。应激主要激活HPA轴,下丘脑产生CRH,经垂体门脉系统进入垂体前叶,刺激 ACTH的释放,ACTH作用于肾上腺皮质,促进CORT的分泌,而CORT的分泌反过来又抑制ACTH和CRH的释放,形成负反馈机制。研究表明,束缚应激后小鼠血清中CORT水平较正常明显升高[46]。除了以上指标外,内分泌轴系统也参与应激反应。因此,可以反应应激的常用指标除去甲肾上腺素、甲状腺素、CRH、ACTH和CORT外,还有阿片肽、多巴胺、生长抑制素和P物质等。其中,CORT是评价针灸研究中最常见的应激指标之一,可以高度准确地反映动物对急性应激源的反应。相关研究表明,中性粒细胞:淋巴细胞比率（NE:LY）也可以有效评价慢性应激。实验室指标相对客观地反映动物整体激素水平的变化[25]。因此,生长代谢、神经内分泌和免疫功能相关指标,都可用于应激评价。由于实验室指标评估并不能区分困扰或轻度痛苦,因此应综合参考行为学评价与实验室指标进行应激的有效评估[47]。

4 讨论

在针灸效应评价中,应该充分考虑固定应激对动物机体生理、病理的影响以准确评价针灸疗效。应激产生的良性反应,有助于疾病的改善,因此忽略应激良性效应因素可能导致针灸的治疗效应加大,或产生假阳性结果;应激产生的损伤性反应,可能导致疾病的进一步加重,忽略应激非良性效应因素可能导致针灸的治疗效应减小,或产生假阴性结果。在针灸实验研究中,因固定导致的应激很难避免,为了实验的准确性,应尽量减小固定应激对针灸效应的干预,或在实验中设置固定对照组用于分析应激效应对于针灸效应的影响。为了明确固定方法对针灸效应的干预,在正式开展实验前,应首先进行应激评估,并在此基础上选择合适的动物固定方法。

应激评估过程包括①在正式实验前进行应激评估预实验,根据行为学指标与实验室指标,对实验动物因固定而产生的应激进行评估;②正式实验前动物进行固定适应性锻炼,通过训练,使动物产生适应,以达到最小化应激反应,避免对针灸疗效产生过大影响[38];③在正式实验中,对鼠类的单次固定时间尽量控制在30 min以内;④在针灸治疗疾病模型疗效评估时,应关注固定应激对相关指标的干预。

固定方法的选择原则具体为①治疗取穴位于动物头背部、四肢外侧等部位,建议优先选择置高台固定法,其次选择网罩、固定器固定;②治疗取穴位于动物腹部、四肢内侧等部位,建议选择网罩或固定器固定;③常规情况下不建议采用捆绑固定法。如果在特殊实验条件下,不适合采用置高台、网罩、固定器固定等方法,最终可考虑采用捆绑固定法。