抗增殖蛋白1对绝经后大鼠成骨细胞分化的影响及机制研究

陈灼均，张瑜生，蒙英，肖徳乾，周志昆

（广东医科大学，广东 东莞 523000)

绝经后骨质疏松症（PMOP)是常见于中老年妇女的一种代谢性骨病，妇女绝经后卵巢功能减退，雌激素水平急剧下降后导致骨骼微环境紊乱，表现为骨量降低、骨微结构破坏，致骨脆性增加，易发生骨折［1］。成骨细胞（OB)是骨质疏松发生的重要细胞，OB具有多种功能蛋白，如碱性磷酸酶（ALP)、骨桥蛋白（OPN)、Runt相关转录因子2（RUNX2)等以维持骨骼的结构［2］。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K)是一种脂类激酶，根据其亚基结构及底物的特异性，可分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型，具有磷脂酰肌醇激酶和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的双重活性［3］。AKT是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，以PI3K依赖的形式被细胞外因子磷酸化和激活。AKT有3种亚型，分别是AKT1、AKT2、AKT3，AKT1和AKT2在成骨细胞中高度表达［4-5］。抗增殖蛋白主要有PHB1和PHB2两种亚型，都属于SPFH（stomatin/prohibitin/flotillin/HflKC)蛋白家族，具有高度保守性，它参与多种细胞功能，包括能量代谢、增殖、凋亡和衰老［6］等。本课题组前期研究［7］表明OB经黄芪三仙汤含药血清干预后，可引起PMOP大鼠成骨细胞的蛋白差异表达，以PHB1最为显著，本研究探讨PHB1对绝经后成骨细胞增殖分化的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物实验所用动物为清洁级3月龄雌性SD大鼠60只，由广州中医药大学实验动物中心提供［动物许可证号：SCXK（粤)2013-0034］。

1.2 仪器、药物与试剂Annexin V-APC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒购于江苏凯基生物技术股份有限公司；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒购于碧云天生物技术有限公司；BCA蛋白测定试剂盒购于上海博彩生物科技有限公司；重组腺病毒购于赛业苏州生物科技有限公司；低速离心机购于上海托莫斯科学仪器有限公司；多功能酶标仪购于美国Bio-Rad公司；显微镜购于重庆奥特光学仪器有限公司；细胞恒温培养箱购于美国Thermo公司。

1.3 PMOP模型建立、成骨细胞提取和原代培养将SPF级的SD雌性大鼠进行呼吸麻醉和消毒，进行背部切口切除双侧卵巢，手术后大鼠常规饲养。用酶消化法从大鼠的颅骨中提取成骨细胞，将细胞培养在含有15%胎牛血清（FBS)和1%青霉素-链霉素溶液的α-MEM培养基中，在95%空气、5%CO2、37℃的条件下进行培养。将第三代成骨细胞种植在相应的孔板中，待细胞密度增殖到60%后进行相应的操作。将PMOP OB（10×104)接种于6孔板中，待细胞贴壁稳定后，PMOPOB分组如下：①空白组；②过表达PHB1组；③沉默PHB1组。

1.4 腺病毒载体的建立及感染通过PCR拼装成PHB1基因，而后进行构建腺病毒载体、包装、滴度测定以及感染成骨细胞。腺病毒感染成骨细胞程序：①腺病毒转染前18～24 h，每个孔细胞的数量为2×105左右；②第二天更换培养基，并加入适量病毒悬液于37℃孵育；③6 h后更换培养基，继续培养24 h，更换培养基，48 h后可见明显荧光表达。

1.5 碱性磷酸酶染色分析将2.5×104个第三代正常OB接种培养于24孔板中，在5%CO2，37℃条件下待细胞密度增殖到60%更换培养基，过表达PHB1组、沉默PHB1组分别用过表达PHB1腺病毒、低表达PHB1腺病毒感染PMOPOB，空白对照组不做感染处理。24 h后更换新鲜15%胎牛血清培养液，培养72 h后进行ALP染色。用BCIP/NBT法进行碱性磷酸酶染色，弃去培养液，PBS洗涤细胞表面，向每孔内加入固定液固定2 min后，加入染色液在室温下避光孵育30 min，PBS清洗2 min，观察并拍照，肉眼可见蓝紫色颗粒沉淀即为成骨细胞发生分化。

1.6 成骨细胞矿化实验将2.5×104个第三代正常OB接种培养于24孔板中，在5%CO2，37℃条件下待细胞密度增殖到60%更换培养基，过表达PHB1组、沉默PHB1组分别用过表达PHB1腺病毒、低表达PHB1腺病毒感染PMOPOB，空白对照组不做感染处理。24 h后，更换新鲜15%胎牛血清培养液，并加入矿化诱导液。培养28天，直至显微镜下观察出有砂质状的矿化结节分布，此时用0.1%茜素红S染色液对细胞进行染色，后用酶标仪测定矿化钙离子浓度，期间每隔两天半量换液，最后用显微镜拍照记录。

1.7 蛋白免疫印迹法取生长状态良好的第3代PMOPOB接种于6 cm培养皿中，在完全α-MEM中培养至90%融合，过表达PHB1组和沉默PHB1组均加入矿化诱导液，分别诱导1、2、3、4、5 d，空白对照组加入完全α-MEM培养液，每组3个复孔。按PMSF∶RIPA=1∶100比例配置裂解液裂解各组细胞，收集，4℃下12 000转离心取上清液，BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度后进行蛋白变性。采用SDSPAGE完成蛋白质电泳分离蛋白，湿法转膜转印至PVDF膜上，室温下封闭1 h，加一抗4℃下孵育过夜，TBST洗膜，加二抗室温孵育1 h，再次TBST洗膜，用ECL发光试剂显色，转至暗室中压片，洗片，晾干，用扫描仪扫描图像，计算机中进行灰度分析，以检测各组细胞PHB1、RUNX2、OPN、PI3K/AKT蛋白表达水平。

1.8 统计分析采用SPSS 19.0统计学软件处理数据，计量资料用均数±标准差（±s)表示，组间比较采用单因素的方差分析（one-way ANOVA)，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PMOP OB碱性磷酸酶染色及茜素红S染色鉴定PMOP OB经碱性磷酸酶染色后，在倒置显微镜下观察，几乎所有细胞的细胞质、细胞膜及周围均有蓝紫色的细微颗粒或片状沉淀，表明成骨细胞纯度很高。PMOPOB培养25天后，由茜素红S染色鉴定均出现矿化结节。见图1（20×)。

图1 PMOP OB的碱性磷酸酶染色（A）和茜素红S染色鉴定（B）

2.2 重组腺病毒的载体构建及感染成骨细胞重组腺病毒的载体构建基因合成：www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/检索rPHB1基因序列，将化学合成的DNA Oligo通过PCR的方法拼装成PHB1基因。腺病毒表达载体由赛业生物科技有限公司完成。空白组：pAV[Exp]-CMV＞EGFP；过表达组：pAV[Exp]-CMV＞rPHB1：T2A：mCherr；空白组：AV-U6＞Scramble-shRNAPGK＞EGFP；沉默组：AV-U6＞Rat Phb[shRNA]-PGK＞EGFP。当感染复数为200时，成骨细胞绝大部分都显示出了明显荧光。感染复数为400时，虽然荧光强度大，但是可以看到飘散的死细胞，推测感染复数过大对细胞活性产生的影响，因此选用感染复数为200的腺病毒浓度用于接下来的研究。

2.3 PHB1在PMOP OB内的表达PMOPOB按最佳的重组腺病毒感染条件感染，将PMOPOB（10×104)接种于6孔板中，待细胞贴壁稳定后将PMOPOB分组：①用AdCMV-EGFP感染的空白组；②用AdCMV-PHB1感染的过表达PHB1组；③用AdPGK-PHB1感染的沉默PHB1组；培养至24 h使细胞汇合率达50%时进行重组腺病毒感染。Western Blot结果显示PHB1在过表达PHB1组中高表达，在沉默PHB1组中低表达。见图2。

图2 PMOP OB中PHB1的蛋白表达

2.4 PHB1对PMOP OB分化及矿化的影响 用腺病毒感染PMOP OB，观察PHB1过表达和沉默表达后对PMOP OB分化及矿化的影响。与空白组相比，ALP活性和染色的结果显示过表达PHB1组显著抑制成骨细胞的分化，而沉默PHB1组的染色强度高于空白组，可促进成骨细胞的分化。过表达PHB1组显著抑制PMOP OB的矿化作用，而沉默PHB1组的染色颜色较深，同时，28天后钙结节溶解，沉默PHB1组钙离子浓度高于空白组。见图3。

图3 PHB1对PMOP OB分化和矿化的影响

2.5 PHB1对成骨矿化相关蛋白的影响通过蛋白质印迹试验检测过表达和沉默表达PHB1基因后OPN和RUNX2蛋白的表达量。过表达PHB1基因后，PMOPOB中OPN和RUNX2的蛋白表达量下调，与空白组相比差异有统计学意义（P＜0.05)。PHB1沉默表达后，PMOP OB的OPN和RUNX2蛋白表达量上调，与空白组相比差异有统计学意义（P＜0.05)。见图4。

图4 Western Blot检测PHB1对OPN、RUNX2表达的影响

2.6 PHB1对PI3K/AKT信号通路的影响过表达PHB1组中p-AKT/AKT的相对表达量降低，而沉默PHB1组中p-AKT/AKT的相对表达量升高，差异有统计学意义（P＜0.05)。见图5。

图5 Western Blot检测p-AKT/AKT的蛋白相对表达

3 讨论

成骨细胞的分化受多种调控因子的调控，在前期快速表达骨桥蛋白（RUNX2)，同时也诱导Sp7的表达，进一步共同参与了OB的成熟，为OB接下来的矿化做准备。而OB的后期，OB的增殖减慢，碱性磷酸酶（ALP)高度表达，随着OB的成熟而达到表达高峰，ALP可促进OB的矿化。后期成熟OB高度表达骨桥蛋白（OPN)、骨钙素（OCN)等，促进OB的矿化能力［8］。因此，OPN、RUNX2均是检测OB活性的良好蛋白指标。PI3K是一类脂类激酶，能整合生长因子、细胞因子和其他环境信号，将其转化为能调节多种信号通路的细胞内信号。药物在改善PMOP模型的骨密度和股骨干骺端的骨小梁微观结构同时，PI3K、AKT和RUNX2的蛋白表达量上升［9］。因此，PI3K/AKT信号通路在抗骨质疏松的机制中发挥重要作用。本研究构建PMOP大鼠模型并提取PMOPOB，通过构建PHB1过表达和低表达模型分析PHB1对PMOP OB分化的影响及可能机制。在分化和矿化实验中，PHB1过表达导致了PMOPOB分化和矿化程度降低，而PHB1低表达导致了PMOP OB分化和矿化程度升高。在Western Blot试验中，当PHB1过表达时，OPN、RUNX2和p-AKT/AKT蛋白表达量下降，而PHB1低表达时结果相反。因此，PHB1对PMOPOB分化和矿化过程具有一定的负调节作用，从而导致PMOPOB分化和矿化程度降低，且这种负调节作用依赖于PHB1对PI3K/AKT通路的负反馈调节。综上所述，PHB1负调控大鼠PMOPOB的成骨分化，其通过负反馈调节PI3K/AKT通路从而抑制PMOP OB的成骨分化，PHB1有望成为骨质疏松研究的新靶点。