不同炮制品组方的补阳还五汤抗大鼠脑缺血再灌注损伤保护作用的比较研究

李卫先，李达

（湖南中医药高等专科学校，湖南 株洲 412012)

脑缺血再灌注损伤是指脑缺血恢复血液灌流之后，缺血区出现由血流再通所致的一系列病理损伤过程，其致死率和致残率高，是危害人类健康的重要疾病之一。补阳还五汤是清代名医王清任创立的益气活血名方，是目前治疗脑缺血病应用最多的方剂［1］，全方由黄芪、当归、赤芍、地龙、川芎、红花、桃仁等7味中药组成。该方具有良好的抗脑缺血损伤作用。方中黄芪有生黄芪、蜜黄芪，当归、赤芍、川芎、地龙等药除有生品外，还有酒制品等炮制品，但原方并未阐明方中各药所用的具体炮制品。各饮片在方中炮制品的选择是本方疗效发挥的关键问题，因此找出特定药效条件下的补阳还五汤中黄芪、当归、赤芍、川芎、地龙所应运用的具体炮制品，并对其抗脑缺血损伤作用进行比较研究，为临床上该方防治缺血性脑血管疾病提供药理学依据。

1 材料

1.1 实验动物成年健康清洁级SD大鼠，雄性，体质量250～320 g，均由湖南中医药大学动物实验中心代购。

1.2 药物与试剂实验所用药材黄芪、当归、赤芍、地龙、川芎、红花、桃仁等均由湖南中医药高等专科学校附属一医院提供，按《中国药典》 （2020一部)鉴定为合格药材。硫酸氢氯吡格雷片（75 mg/片)，由赛诺菲制药有限公司生产。

2 方法

2.1 样品的分组及提取

2.1.1 样品的分组 补阳还五汤按《方剂学》教材规定的剂量称取。各药用量为：黄芪120 g、当归尾6 g、赤芍4.5 g、地龙3 g、川芎3 g、红花3 g、桃仁3 g，水煎液。方剂1组：各组成成分均为生品组方的补阳还五汤；方剂2组：黄芪蜜炙，当归、赤芍、川芎、地龙均酒炙，其他药物均为生品组方的补阳还五汤；方剂3组：黄芪蜜炙，其他药物均为生品组方的补阳还五汤；方剂4组：当归、赤芍、川芎、地龙均酒炙，其他药物均为生品组方的补阳还五汤。

2.1.2 样品的提取 以上各组按量称取各药后常温（25℃)加蒸馏水2 000 mL浸泡30 min，煮沸后文火煎30 min过滤药液，药渣加1 000 mL蒸馏水再煎煮25 min，合并两次滤液，浓缩至补阳还五汤约2.0 g/mL，放入4℃冰箱备用。

2.2 脑缺血再灌注模型制备脑缺血再灌注模型制备［2］按以下方法：给药2周后大鼠不禁水禁食12 h，用10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠（0.3 mL/100 g)，颈部正中切口，钝性分离左侧颈总动脉（CCA)、左颈内动脉（ICA)和左颈外动脉（ECA)，用微血管夹将颈总动脉在近分叉处夹闭，将直径0.2 mm涂有硅酮的尼龙线从颈外动脉插入至颈内动脉远端，阻断大脑中动脉血流，然后将微血管夹取掉，将颈外动脉结扎，使大鼠脑缺血（判断远端结扎无血流的方法：大鼠脸呈苍白色，瞳孔放大，翻正反射消失，说明产生前脑缺血)，留约1 cm的线头在外侧，于缺血2 h时轻提尼龙线，使其球端回至颈外动脉内，即可恢复大脑中动脉（MCA)血供。假手术组ICA不插线栓，仅分离血管。以上过程均在室温恒定（24℃～25℃)情况下进行，以利于评价脑缺血情况。

2.3 分组与给药将大鼠随机分为7组，每组25只。即假手术组、模型组、氢氯吡格雷组以及不同炮制品组方的补阳还五汤方剂1、2、3、4组。适应性饲养各组大鼠1周后，参照动物与人体等效换算标准换算［3］，给予相应的药物。方剂组按13 g·kg-1·d-1量灌胃，氢氯吡格雷组给予0.68 mg/mL氢氯吡格雷水溶液灌胃，模型组与假手术组均给予等量生理盐水灌胃，每天2次，连续2周。

2.4 大鼠实验性脑缺血行为评分法造模24 h后，参考Zea Longa的5级4分评分法评估大鼠脑神经功能损伤，观察大鼠四肢的活动能力及反应能力并进行评分（评分标准：无神经病学征象记为0分，提尾时病灶对侧前肢不能完全伸直为1分，向瘫痪侧旋转为2分，向病灶对侧跌倒为3分，无自发活动及意识障碍为4分)，正常评分为0分，最高评分为4分。积分越高说明动物行为障碍越严重。

2.5 血清各指标的测定

2.5.1 ELISA法检测血清PAF、CD62p、CD63含量 大鼠麻醉后用普通真空管腹主动脉取血约10 mL，3 000 r/min，离心30 min，吸取上层血清，置于-80℃冰箱备测。采用酶联免疫定量检测技术检测大鼠血清PAF、CD62p、CD63含量。操作过程严格按照说明书进行。

2.5.2 检测血清TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA水平和LDH活性 按上述方法取血清，ELISA法检测血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平；按试剂盒方法测定血清MDA水平及LDH活性［4］，具体步骤严格参照试剂盒说明书操作。

2.6 统计方法采用SPSS 20.0统计软件包中One-Way ANOVA进行数据的统计分析。方法以均数±标准差（±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组对大鼠神经功能缺失症状评分及对急性脑缺血再灌注大鼠血清PAF、CD62p、CD63含量的影响表1结果显示，与假手术组比较，模型组的所有试验动物均出现了不同程度的行为障碍，模型组血清PAF、CD62p、CD63表达显著升高（P＜0.05)；与模型组比较，氢氯吡格雷组与不同炮制品组方的补阳还五汤方剂1、2、3、4组均能显著抑制血清PAF、CD62p、CD63表达（P＜0.05)，表明补阳还五汤能显著抑制血小板活化，且各组的效果均强于方剂1组（P＜0.05)，其中方剂2组的效果强于方剂3组、方剂4组、氢氯吡格雷组（P＜0.05)，方剂3组、方剂4组、氢氯吡格雷组间无显著差异（P＞0.05)。

表1 各组脑缺血再灌注大鼠PAF、CD62p、CD63含量及术后评分的影响（±s）

表1 各组脑缺血再灌注大鼠PAF、CD62p、CD63含量及术后评分的影响（±s）

注：与假手术组比较，△P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01，*P＜0.05；与方剂1组比较，##P＜0.01，#P＜0.05。

组别 n CD63（ng/mL) PAF CD62p 术后评分（分)假手术组 25 0.738±0.146 0.012±0.002 0.106±0.015 0模型组 25 1.586±0.253△ 0.215±0.012△ 0.196±0.008△ 3.26±0.48△氢氯吡格雷组 25 0.813±0.167** 0.145±0.014** 0.132±0.021** 2.74±0.51**方剂1组 25 1.316±0.154* 0.171±0.006* 0.162±0.013* 2.68±0.37*方剂2组 25 0.741±0.162**## 0.131±0.011**## 0.116±0.018**## 1.83±0.21**##方剂3组 25 0.923±0.158*# 0.155±0.006*# 0.141±0.006*# 2.43±0.43*#方剂4组 25 0.835±0.138*# 0.142±0.008*# 0.134±0.005*# 2.24±0.28*#

3.2 各组对脑缺血再灌注损伤大鼠血清LDH活性和MDA、TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影响表2结果显示，与假手术组比较，模型组的大鼠血清LDH活性和MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著升高（P＜0.01)。与模型组比较，氢氯吡格雷组和不同炮制品组方的补阳还五汤方剂1、2、3、4组均可显著抑制大鼠血清中LDH活性和MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6水平的升高（P＜0.05，P＜0.01)，且各组的效果均强于方剂1组（P＜0.05)，其中方剂2组的效果强于方剂3组、方剂4组、氢氯吡格雷组（P＜0.05)，方剂3组、方剂4组、氢氯吡格雷组间无显著差异（P＜0.05)。

表2 各组对脑缺血再灌注大鼠血清LDH、MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影响（±s）

表2 各组对脑缺血再灌注大鼠血清LDH、MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影响（±s）

注：与假手术组比较，△P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01，*P＜0.05；与方剂1组比较，##P＜0.01，#P＜0.05。

组别 n LDH（U/L) MDA（nmol/mL) TNF-α（ng/L) IL-1β（ng/L) IL-6（ng/L)假手术组 25 2783±274 3.61±1.14 43.4±3.8 22.6±1.3 24.5±1.3模型组 25 4672±512△ 8.76±1.32△ 49.5±4.1△ 31.5±2.2△ 29.7±1.6△氢氯吡格雷组 25 3547±604** 6.54±0.76** 45.7±3.2** 25.8±1.7** 26.3±1.2**方剂1组 25 3563±536* 7.25±1.02* 47.4±2.9* 29.3±1.5* 27.5±2.4*方剂2组 25 2935±328**## 5.37±0.87**## 43.6±2.1**## 23.1±0.8**## 25.1±1.8**##方剂3组 25 3272±457*# 6.83±0.53*# 46.1±3.4*# 27.4±2.3*# 26.8±2.1*#方剂4组 25 3161±388*# 6.57±0.91*# 45.6±2.5*# 26.1±1.6*# 26.6±1.9*#

4 讨论

脑缺血后的再灌注是神经功能恢复的基本条件，但也会导致内皮细胞和微血管损伤，由于脑组织急性缺血缺氧产生大量的自由基，与脑组织细胞膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，释放大量的脂质过氧化产物MDA、LDH及炎性因子和细胞凋亡因子［5-6］，从而使脑组织损伤进一步加重，造成严重的迟发性神经功能损害［7］。TNF-α具有增加血管内皮细胞的通透性，诱导细胞黏附因子表达等作用，在脑缺血早期TNF-α分泌或合成的增加是脑梗死形成的主要原因。IL-1β是一种内源性致热源，其表达升高可以通过刺激内皮细胞表达白细胞粘附分子，使白细胞聚集在缺血脑组织，加重脑缺血再灌注损伤程度。IL-6参与机体免疫应答和炎性反应，是急性缺血期脑损伤程度的一个标志［8］。本研究中，模型大鼠的血清LDH活性、MDA以及NF-α、IL-1β和IL-6相关细胞因子水平均升高，表明脑缺血后诱导模型大鼠炎性细胞因子的分泌和表达，引起缺血后炎性反应。不同炮制品组方的补阳还五汤均可不同程度改善大鼠脑缺血再灌注后神经功能症状，并显著抑制大鼠血清LDH活性的升高，降低血清MDA和TNF-α、IL-1β、IL-6水平，且各组均优于方剂1组（生品组)，其中黄芪蜜炙，当归、赤芍、川芎、地龙均酒炙组方的补阳还五汤组抑制作用更显著。

PAF和CD62p、CD63均可促进血小板的活化和聚集，脑缺血再灌注时PAF和CD62p、CD63大量释放，促进血小板聚集并触发炎性反应，诱导血栓形成，加重脑缺血对神经元造成的损伤。本研究结果显示，不同炮制品组方的补阳还五汤均可不同程度降低血清PAF和CD62p、CD63表达水平，且各组均优于方剂1组（生品组)，其中黄芪蜜炙，当归、赤芍，川芎、地龙均酒炙组方的补阳还五汤组降低作用更显著。

综合文献报道及本研究，补阳还五汤组方中黄芪用蜜炙品，当归、赤芍，川芎、地龙均用酒炙品，抗脑缺血再灌注损伤的保护作用最显著，这与文献中记载的黄芪蜜炙可增强免疫功能、抗氧化、增加冠脉流量对心功能起到保护作用，当归、赤芍、川芎、地龙酒炙能增强活血通络、溶血栓、抗炎、止痛作用是一致的，其机制与抑制血小板活化、抑制炎性因子分泌和表达及减轻脑组织炎性反应有关。