一株降解DON芽孢菌的筛选鉴定及其发酵饲料应用

■赖根生 李 洁 刘子睦 薛鲜丽，3 王德培，3*

（1.工业发酵微生物教育部重点实验室，天津 300457；2.天津市微生物代谢与发酵过程控制技术工程中心，天津 300457；3.天津科技大学生物工程学院，天津 300457）

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）又名呕吐毒素，是由镰刀菌属所产生的一种单端孢霉烯族毒素[1]。在禾本科作物生长过程中极易感染的镰刀菌属病害导致采收后各主要粮食籽粒被毒素污染，同时，在饲料的加工和储存中极易由于霉变而产生各种霉菌毒素，其中以DON污染最为广泛[2]。呕吐毒素是饲料及饲料原料中污染最普遍的霉菌毒素。有报道2019 年呕吐毒素在饲料及原料样品中检出率高达93.22%，超标率27.42%，在检测的毒素中最为突出，并且相比2018 年检测结果，呕吐毒素污染更为严重[3]。DON 具有较强的耐热和耐酸能力，在pH 10.0，170 ℃加热15 min 才能完全被破坏[4]，因此在以粮食作物为原料的食物和饲料的加工过程中，DON基本不被破坏或降解，故广泛在食物链中流通[5]。DON 具有较强的毒性，猪摄入0.1～0.2 mg/kg 的DON 就会引起呕吐，进而引起食欲下降、生长迟缓、抵抗力下降等，若长期给动物喂食含有DON 的饲料，更是会给养殖业特别是养猪业造成巨大的损失[6-7]。若人体长期食用含DON的粮食作物或被DON污染饲料所饲养的动物及其畜产品，也会造成如免疫力下降、软骨组织坏死等极大的危害[8]。

DON的脱除方法有物理法、化学法和生物法。物理法去除DON 会造成粮食营养流失，同时可能产生新的有害物质，且成本大；化学法去除DON，污染大，可能增加新的未知物质；生物处理过程温和且利于大规模使用，特别是微生物法脱除DON 是目前最经济有效的方法[9-11]。因此，筛选出能够高效且安全降解DON的微生物菌株是近年来的研究热点[12]。

在国内外已有大量有关微生物脱除DON 的研究。从20世纪70年代起，有研究表明DON最主要的毒性位点是C12、C13的环氧结构，其可能作用的机理是抑制细胞中的蛋白质合成[13]。之后陆续有报道微生物可通过分解环氧结构降解DON。Yoshizawa 等[14]报道，动物肠道中的细菌可以分解单端孢霉烯中的环氧结构，DON 的降解产物为C12 和C13 形成双键的物质。Fuchs等[15]采用气质联用（GC/MS）和颗粒束界面-质谱联用（LC-PB-MS）方法，确定了BBSH797菌株降解DON 的代谢产物为DOM-1。He 等[16]发现，鸡肠道中微生物在96 h内可转化98%以上的DON标品，转化产物鉴定为DOM-1，可将DON的环氧环打开，产物毒性远远低于DON。Eriksen 等[17]通过毒性试验研究发现，DOM-1的毒性为DON的1/55。Li等[18]研究表明芽孢杆菌LS100 可将呕吐毒素转化成DOM-1，并通过仔猪饲喂试验，发现降解产物DOM-1不会对猪产生负面影响。另一方面，乳酸菌对DON等真菌毒素具有吸附作用，对降低DON含量、减少对动物损伤有一定的作用。胡杉杉等[19]分离出一株副干酪乳杆菌，对DON去除率达40.4%，且对DON有耐受能力。El-Nezami等[20]研究了鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosusGG）对DON的去除作用，发现活菌和灭活的菌株在去除DON能力上没有显著差异，且未发现新物质生成，表明Lactobacillus rhamnosusGG通过吸附作用去除DON。

本文旨在筛选和鉴定出能够高效、安全降解和去除DON的微生物，同时尝试将其应用在饲料发酵中，以期能够在获得优良的发酵饲料的同时使其DON含量和对畜禽的毒性降低，一方面发掘利用新的微生物资源，为我国发酵饲料的发展奠定基础，另一方面为微生物降解霉菌毒素的研究提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

玉米胚芽粕、玉米小杂、喷浆玉米皮（黑龙江金象生化有限责任公司），实验室保藏的野生芽孢菌54株和乳酸菌12株。

1.1.2 主要试剂

苯基环氧乙烷（上海皓鸿生物医药科技有限公司）；DON标准品（美国Sigma公司）；呕吐毒素酶联反应检测试剂盒AgraQuant COKAQ4000（美国ROMER公司）。

1.1.3 培养基

LB 固体培养基：胰蛋白胨10 g、酵母膏5 g、NaCl 10 g、琼脂20 g、蒸馏水1 L，pH 7.0～7.4。

LB 液体培养基：胰蛋白胨10 g、酵母膏5 g、NaCl 10 g、蒸馏水1 L，pH 7.0～7.4。

初筛培养基：（NH4）2SO41 g、KH2PO43 g、K2HPO46 g、NaCl 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、CaCl20.05 g、FeSO4·7H2O 0.001 g、蛋白胨0.05 g、琼脂20 g、蒸馏水1 L，pH 6.0～7.0。灭菌后加入过滤除菌的苯基环氧乙烷，终浓度为15 mmol/L。

复筛培养基：胰蛋白胨10 g、酵母膏5 g、NaCl 10 g、DON 1 mg、蒸馏水1 L，pH 7.0～7.4。

MRS培养基：蛋白胨10 g、牛肉膏5 g、酵母粉5 g、葡萄糖20 g、乙酸钠5 g、柠檬酸三铵2 g、吐温80 1 g、K2HPO42 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、MnSO4·H2O 0.05 g、CaCO35 g、蒸馏水1 L、琼脂18 g，pH 6.2～6.6，115 ℃高压灭菌15 min。

饲料发酵培养基：玉米胚芽粕17 g、玉米小杂17 g、玉米皮17 g、水40 mL，pH 6.0。无需灭菌。

以上培养基除特殊说明外均需121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

1.1.4 仪器与设备

光学显微镜（OLYMPUS 公司）；高压蒸汽灭菌锅LDZX-50FB（上海申安医疗器械厂）；生化培养箱LRH-250-A（韶关市泰宏医疗器械有限公司）；恒温振荡培养箱（天津市天宇机电有限公司）；PCR 仪（美国BIO-RAD公司）；电泳仪（美国BIO-RAD公司）；酶标仪Infinite 200PRO（奥地利TECAN公司）；紫外可见分光光度计（天津市华伟科技有限公司）；物传感分析仪SBA-40E（山东省科学院生物研究所）。

1.2 DON降解菌的筛选与鉴定

1.2.1 DON降解菌株的初筛

将实验室保藏的54 株芽孢菌在LB 平板上划线活化，37 ℃培养12 h，再挑取单菌落分别划线到初筛培养基，37 ℃培养3 d，挑选出生长良好的菌株进行下一步筛选。

1.2.2 DON降解菌株的复筛

取初筛菌株中生长良好的菌株接种于5 mL LB液体培养基，37 ℃、180 r/min 摇床培养12 h。按2%的接种量将菌液接种到50 mL 液体复筛培养基中，37 ℃、180 r/min 摇床培养16 h。以未接菌的复筛培养基为对照。取培养液1 mL，以8 000 r/min 转速离心10 min，取上清液，通过0.22 μm 微孔滤膜过滤，稀释一定的倍数后使用ELISA试剂盒检测DON残余量，计算菌株对DON的降解率。选取DON降解率高的菌株并保藏试管斜面。

1.2.3 菌株鉴定

将筛选菌株单菌落划线于LB 培养基平板，37 ℃培养24 h，观察菌落形态，并挑取部分单菌落进行革兰氏染色，在光学显微镜下观察细胞形态。

将筛选菌株单菌落接种于LB 液体培养基中，37 ℃、180 r/min 振荡培养12 h，取菌液稀释并置于PCR 仪中98 ℃裂解10 min，以裂解菌液做模板，以通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）对菌株16S rDNA基因进行PCR扩增。PCR体系：模板1 μL，上游引物27F和下游引物1492R各1 μL，DNA聚合酶12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR程序：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s并循环30次，72 ℃再延伸10 min。

以通用引物UP1（5’-GAAGTCATCATGACCGTT CTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3’）和UP2r（5’-CA GGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNG-3’）对菌株gyrB基因进行PCR 扩增。PCR 体系：模板1 μL，上游引物UP1和下游引物UP2r各1 μL，DNA聚合酶12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR 程序：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s、61 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s并循环35次，72 ℃再延伸10 min。

PCR产物取2 μL进行琼脂糖凝胶电泳验证后，将产物送往GENEWIZ 进行测序，测序结果通过美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）数据库进行比对，选取同源性高的16S rDNA 基因和gyrB基因序列，分别通过MEGA 7以邻接法（Neighbour-joining，NJ）构建系统发育树。

1.2.4 脱除DON的乳酸菌筛选

将实验室保藏的12株产酸乳酸菌从斜面保藏试管接到MRS培养基平板，42 ℃厌氧培养1 d，挑取单菌落接种到含有1 μg/mL DON的MRS液体培养基中，42 ℃静置培养48 h，以不接菌的含1 μg/mL DON 的MRS液体培养基为对照，分别取1 mL培养液8 000 r/min离心10 min，取上清液并通过0.22 μm 微孔滤膜过滤，稀释一定的倍数，使用ELISA 试剂盒检测DON 残留量，计算DON脱除率。

1.3 DON降解菌生长曲线

将筛选的DON 降解菌BL-14从斜面保藏试管接种到LB液体培养基中，37 ℃、180 r/min振荡培养12 h作为BL-14 种子液，以2%的接种量将种子液分别接种到添加有1 μg/mL DON的LB液体培养基和无DON的LB 液体培养基中，37 ℃、180 r/min 振荡培养24 h以上，分别在固定的时间点取样并测量培养液的OD600值。

1.4 发酵饲料应用

将筛选出的一株DON降解芽孢菌和两株DON脱除乳酸菌分别从斜面保藏试管接到LB或MRS培养基平板上，芽孢菌以37 ℃培养12 h，乳酸菌以42 ℃培养24 h。再挑取单菌落分别接到LB或MRS液体培养基中，芽孢菌以37 ℃、180 r/min 振荡培养12 h，乳酸菌以42 ℃静置培养24 h。将一株芽孢菌和两株乳酸菌的种子液以3∶1∶1 的比例，以总接种量6%接种到预先混合好的饲料原料中，混匀后装入螺口瓶中压实并密封，室温放置7 d，同时设置不接菌的饲料发酵培养基为对照。

发酵结束后，取10 g 发酵饲料研磨粉碎，倒入90 mL无菌蒸馏水中，180 r/min振荡2 h，取1 mL混合液8 000 r/min离心10 min，吸取上清液并稀释一定的倍数，用磷酸氢二钾调节pH 到6～8，用ELISA 试剂盒检测DON含量，计算DON脱除率，同时使用生物传感分析仪检测乳酸的含量。

2 结果与分析

2.1 DON降解菌的初筛

DON 分子中的C12、C13 环氧基团是其最主要的毒性基团，故使用具有相似的环氧结构的苯基环氧乙烷做唯一碳源，筛选出能够破坏环氧结构以利用苯基环氧乙烷的菌株，初步筛选出可能的DON 降解菌株[21]。对实验室保藏的54株芽孢菌进行初筛，筛选出10 株潜在可能的DON 降解菌BL-1、BL-2、BL-4、BL-8、BL-12、BL-14、BL-d、BL-e、BL-r、BL-x。

2.2 DON降解菌的复筛

通过在培养基中添加一定量的DON 进行发酵，使用DON检测酶联免疫试剂盒直接检测发酵16 h后发酵液中DON 的残留量以进一步筛选出DON 降解菌。从10株潜在的DON降解菌中筛选出3株DON降解率较高的芽孢菌BL-12、BL-14、BL-d，其中BL-14菌株的DON降解率最高，在含有1 μg/mL DON的LB培养基中发酵16 h的DON降解率可达82.63%（见表1）。

2.3 BL-14菌株鉴定

2.3.1 形态

BL-14 菌株在LB 培养基平板上生长，呈月白色圆形菌落，不透明，表面凸起有褶皱、中心有放射状褶皱，易挑起，与培养基结合不紧密，用接种针挑取菌落有黏稠感且湿润（见图1）。在光学显微镜下染色观察BL-14 菌株细胞形态为短杆状革兰氏阳性菌，有部分细胞中有椭圆形透明未染色部分，判断为芽孢（见图2），初步推断该菌为芽孢杆菌属。

图1 菌株BL-14的菌落形态

图2 菌株BL-14的细胞形态

2.3.2 分子鉴定

BL-14 菌株的16S rDNA 序列与贝莱斯芽孢杆菌（Bacilus velezensis）有99.43%的相似度，初步确定BL-14为Bacilus velezensis，将部分不同种的芽孢杆菌属模式菌株的16S rDNA与BL-14的序列构建系统发育树（见图3）。通过比较gyrB基因序列在区分和鉴定细菌近缘种方面比16S rDNA具有更高的分辨率[22]，BL-14 的gyrB基因序列验证鉴定结果，与Bacilus velezensis有99.66%的相似度，与16S rDNA 鉴定结果相符。以BL-14的gyrB基因序列与其在NCBI上比对的同源性相似的部分已知序列构建系统发育树（见图4）。

图3 基于16S rDNA序列菌株BL-14的系统发育树

图4 基于gyrB基因序列菌株BL-14的系统发育树

2.4 乳酸菌脱除DON

从实验室保藏的12株产乳酸能力强的乳酸菌中筛选出2 株DON 脱除率较高的乳酸菌NJ8 和RS1，发酵48 h 对DON 的脱除率分别达28.50%和30.29%（见表2）。

表2 12株乳酸菌对DON的脱除率

2.5 DON降解菌生长曲线及其对DON耐受性

以生长时间（h）为横坐标，菌体浓度OD600值为纵坐标，绘制菌株BL-14在不添加DON和添加1 μg/mL DON 时的生长曲线（见图5）。在添加1 μg/mL DON的环境下，菌株BL-14在2 h左右进入对数生长期，在10 h左右结束对数生长进入稳定期，22 h左右开始衰亡。相比不添加DON 的情况，添加DON 时菌株BL-14对数生长期的时间和生长速率没有明显变化，稳定期时的菌浓度峰值略有降低，且稳定期明显缩短，菌株提前进入衰亡期，衰亡趋势显著。总体来说，BL-14在快速生长阶段对DON有较好的耐受能力，但是可能会因DON影响，难以维持稳定生长而提前衰亡。

图5 菌株BL-14的生长曲线

2.6 发酵饲料应用

将筛选出适用于饲料发酵的产酶丰富、且降解DON 能力较强的芽孢杆菌BL-14 和产乳酸多且有DON脱除能力的乳酸菌NJ8和RS1三株菌以3∶1∶1的比例（芽孢菌∶乳酸菌=3∶2）接种到饲料原料中进行发酵，发酵结束后检测其DON 的降解率（见表3）。结果显示以筛选出的DON 降解菌BL-14 与乳酸菌NJ8、RS1 协同发酵饲料，可将饲料中的DON 含量从3.81 mg/kg降到1.39 mg/kg，降解率最高可达63.52%。同时，发酵结束后乳酸菌数目可达109个/g，并产生约35 g/L的乳酸。另外，从表3中可以看到，DON降解率与发酵后芽孢菌的数目呈现一定的正相关性，可以初步判断在此次发酵中，芽孢菌BL-14起到主要的DON降解作用。

表3 发酵饲料应用试验效果检测

3 讨论

饲料及饲料原料中的DON可通过食物链广泛地扩散，极大地危害畜禽和人类[23]。微生物降解DON具有过程温和、对环境污染小、成本低等优点。另外，在饲料发酵过程中部分微生物的代谢可以降低饲料中毒素的含量，使得发酵饲料中的有害物质含量比未发酵饲料更低[24]。本研究筛选出的菌株BL-14 经鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacilus velezensis），是一种新型的生防微生物菌种，属于好氧的革兰氏阳性菌，营养要求简单、繁殖快、抗逆性强，具有丰富的产酶体系，能够产生抑菌物质抑制肠道致病菌的生长繁殖，对多种动物疾病有防治作用，在发酵饲料中有很大的应用潜力[25-26]。另外，已有研究报道，贝莱斯芽孢杆菌可降解饲料中的常见毒素如玉米赤霉烯酮（ZEN）和黄曲霉毒素B1（AFB1）等。王楠[27]从土壤中筛选出一株Bacilus velezensisA2，可在24 h内将饲料中污染的ZEN（60 mg/kg）完全降解。王明清等[28]以香豆素为唯一碳源从土壤中筛选出一株Bacilus velezensisA6，该菌在37 ℃孵育72 h 可将AFB1 降解90.6%。这些研究表明，贝莱斯芽孢杆菌在降解真菌毒素方面有很大的潜力。除贝莱斯芽孢杆菌外的其他芽孢杆菌属细菌也是如此。徐海军等[29]从母猪粪便中筛选到一株对饲料中污染的呕吐毒素、玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素B1 均有较好的降解作用的芽孢杆菌ODS-1，对三种霉菌毒素降解率均达到70%以上。杜稳等[30]将一株可高效降解DON的枯草芽孢杆菌ASAG-35的发酵工艺优化并制成菌剂投入粮食加工副产物中，最高可脱除粮食副产物中90%以上的DON。梁含等[31]筛选出一株枯草芽孢杆菌LB01 和一株解淀粉芽孢杆菌NA06，其中LB01 对麸皮中呕吐毒素降解率达71%，NA06对豆粕中呕吐毒素降解率高达82%。

本研究筛选出的贝莱斯芽孢杆菌BL-14 不仅可高效降解DON，而且菌株安全无毒且可产丰富的各类水解酶，能够高效降解饲料中的DON 同时能够产淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶，能够将饲料原料中的生物大分子分解为易于畜禽消化吸收的营养小分子物质。菌株BL-14非常适用于饲料添加剂应用在饲料发酵中。将菌株BL-14和两株乳酸菌NJ8、RS1结合协同发酵饲料，可在较短时间内高效降低饲料原料中超标的DON含量，同时可以增加饲料的营养成分，产生较多的乳酸，改善饲料的风味，增加适口性，提高了饲料利用率，并且可以降低动物生产成本，预防DON对动物的损害，对饲料和养殖产业有较大的应用潜力。

对于菌株BL-14降解DON 的机制也做了部分研究，利用高效液相色谱技术（HPLC）检测菌株降解DON的效率和DON降解产物，观察色谱图发现，对于含1 μg/mL DON 的液体培养基，接种了BL-14 培养16 h以后，DON对应的色谱峰峰面积下降了68.75%，但是还未从色谱图中发现新的产物峰出现，后续可能会尝试调整HPLC检测条件和采用高效液相色谱-质谱联用（LC-MS）以期寻找到菌株BL-14 降解DON 的降解产物。同时，在基因层面也对菌株BL-14 降解DON的机制进行研究。根据已报道的有关于DON降解菌的DON降解酶基因的文献，目前已发现的DON降解酶基因主要有来自Devosia mutans17-2-E-8 的Dep A和Dep B基因，来自SphingomonasS3-4 的醛酮还原酶AKR18A1和来自Devosiasp. D6-9的DON脱氢酶QDDH、醛酮还原酶AKR13B2 和AKR6D1[32-35]。将这些酶的基因序列在NCBI数据库中与贝莱斯芽孢杆菌进行比对，发现存在与酶AKR13B2 相似度最高33.44%的醛酮还原酶基因，以此设计引物，从菌株BL-14基因组中克隆出该醛酮还原酶基因并在大肠杆菌中进行表达，却未发现有DON降解活性。表明菌株BL-14降解DON可能存在其他酶降解途径。因此，对于菌株BL-14降解DON的途径还有待进一步的研究。

4 结论

本研究以苯基环氧乙烷为唯一碳源，筛选出10株可能具有DON降解能力的芽孢杆菌，通过复筛筛选出一株DON降解菌BL-14。菌株BL-14在含有1 μg/mL DON 的LB液体培养基中，16 h内DON 降解率可达到82.63%。通过形态学与分子生物学鉴定BL-14为贝莱斯芽孢杆菌（Bacilus velezensis）。又筛选出2株可脱除DON 的乳酸菌NJ8、RS1，DON 脱除率分别为28.50%和30.29%。将筛选出的芽孢杆菌BL-14 与乳酸菌NJ8、RS1协同发酵饲料原料7 d，产生乳酸约35 g/L，在将饲料原料发酵成营养丰富、适口性好的优良饲料的同时，将饲料原料中的DON 含量从3.81 mg/kg 降到1.39 mg/kg，发酵饲料中DON脱除率达63.25%。