饲料中添加乳酸菌和三丁酸甘油酯对克氏原螯虾生长、氨基酸沉积率及消化酶活性的影响

■田立立 刘家鼎 孙龙生* 安振华 杨 阳 刘昊宇 寇祥明 张家宏

（1.扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州 225009；2.江苏省里下河地区农业科学研究所，江苏扬州 225007）

微生态制剂因具有提高机体免疫机能、调控机体代谢、有效改善微生态系统平衡等特性，在水产养殖业中的应用越来越广泛[1]。郑玉等[2]研究发现，在饲料中添加乳酸菌可显著促进凡纳滨对虾生长，提高成活率以及对低盐度的耐受性；在对南美白对虾的研究中发现，三丁酸甘油酯可以显著提高生长性能，减少肠道致病性弧菌数量[3]。目前关于乳酸菌和三丁酸甘油酯在小龙虾（学名：克氏原螯虾，Procambarus clarkii）养殖上的应用鲜有报道，尤其是两者联合添加的效果尚不清楚，作用机制有待探讨。本试验通过在饲料中单独或同时添加乳酸菌和三丁酸甘油酯，研究其对克氏原螯虾生长性能、氨基酸吸收利用及消化生理的影响，为克氏原螯虾绿色饲料的研制提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验虾购自江苏省江都区汤桥家庭农场，挑选初始体重（4.39±0.01）g 克氏原螯虾，用5%盐水浸泡5 min，放入温室水泥池暂养7 d后，开始进行生长试验。

参照前期试验及相关文献[4-5]采用单因子试验设计，将试验幼虾320尾随机分成4组，在基础饲料中添加0.2%乳酸菌粉（Ⅱ组，2×109CFU/g）、0.1%三丁酸甘油酯（Ⅲ组，10%）、0.2%乳酸菌粉和0.1%三丁酸甘油酯（Ⅳ组），对照组投喂基础饲料（Ⅰ组），每组4 个重复，每个重复20 尾虾，分别放养在16 个250 L 养殖桶中，内置孵化草若干作为虾的隐蔽物。每天于7：30、17：30 投喂2 次，分别投喂当天饲料量的40%和60%，表观饱食投喂，日投饲率为虾体重的3%左右，每天记录投喂量与养殖情况。试验用水采用曝气24 h 以上的自来水，微流水，全程增氧，溶氧浓度维持在5 mg/L 以上。试验期间水温24～30 ℃，氨氮浓度小于0.01 mg/L，pH 7.2～8.5，试验期42 d。

1.2 试验饲料

以进口鱼粉、豆粕、菜粕、面粉等为原料配制基础饲料，原料经粉碎、称重后按照配方要求准确添加油脂、预混料及各种添加剂，经仪器混匀后，用F26颗粒饲料挤条机制成直径为1.5 mm 条状物后自然风干，将风干饲料破碎、过筛，保存在-20 ℃冰箱。饲料配方及营养水平见表1。

表1 饲料配方及营养水平（风干基础，%）

1.3 样品采集与指标测定

1.3.1 生长性能

养殖试验结束后，计数，称重，计算成活率、增重率、饲料系数、特定生长率、蛋白质效率、肥满度和肝体指数。

成活率（%）=试验结束尾数（尾）/初始尾数（尾）×100平均增重（g）=结束均重（g）-初始均重（g）

增重率（%）=平均增重（g）/初始均重（g）×100

饲料系数=投饵量（g）/平均增重（g）

特定生长率（%/d）=（ln结束均重-ln初始均重）/天数×100

蛋白质效率=平均增重（g）/[投饲量（g）×饲料蛋白质含量（%）]

肥满度（g/cm3）=体重（g）/[体长（cm）]3×100

肝体指数（%）=肝重（g）/体重（g）×100

1.3.2 氨基酸沉积率

每个重复随机取3尾虾肌肉样，用以氨基酸含量的测定。氨基酸含量的测定采用酸水解结合高效液相色谱法（Agilent 1220 Infinity LC，德国），氨基酸沉积率的计算参照伍代勇等[6]的方法：氨基酸沉积率（%）=[（虾体增重（g）×虾体肌肉中干物质含量（%）×虾体肌肉中该氨基酸含量（%）]/[饲料消耗量（g）×饲料中干物质含量（%）×饲料中该氨基酸含量（%）]×100。

1.3.3 消化酶活性

每个重复随机取3尾虾，分离肠道，液氮速冻。准确称取待测组织重量，按重量（g）∶体积（mL）=1∶9的比例加入9倍组织重量的生理盐水，并在冰水浴条件下机械匀浆，离心10 min后取上清液制成10%浓度的组织匀浆，-20 ℃保存备用。酶活性测定指标包括胃蛋白酶、胰蛋白酶、α-淀粉酶、脂肪酶等，具体测定方法参照南京建成生物工程研究所相关试剂盒说明书。

1.4 数据处理

用Excel 软件记录数据，SPSS 16.0进行单因素方差分析（one-way ANOVA）。多重比较采用Duncan’s法，显著水平设定为P＜0.05，试验数据以“平均值±标准差（Mean±SD）”表示。

2 结果与分析

2.1 饲料中添加乳酸菌和三丁酸甘油酯对克氏原螯虾生长性能的影响（见表2）

表2 饲料中添加乳酸菌和三丁酸甘油酯对克氏原螯虾生长性能的影响

各组间克氏原螯虾初重、饲料系数、肥满度、成活率均没有显著差异（P＞0.05）；第Ⅱ组虾末重、增重、增重率、特定生长率显著高于其他组（P＜0.05），蛋白质效率第Ⅱ组最高，其次是第Ⅰ组，且显著高于其他两组（P＜0.05）；肝体指数以第Ⅱ组最高，Ⅲ组和Ⅳ组肝体指数显著低于对照组（P＜0.05）。

2.2 饲料中添加乳酸菌和三丁酸甘油酯对克氏原螯虾肌肉氨基酸沉积率的影响（见表3）

由表3可知，克氏原螯虾对氨基酸的沉积率总体不高，不同氨基酸间存在较大差异。Ⅰ、Ⅳ组天冬氨酸沉积率均为最高，谷氨酸次之，精氨酸居第三；Ⅱ组天冬氨酸沉积率最高，其次为甲硫氨酸；Ⅲ组则是天冬氨酸沉积率最高，甲硫氨酸居第二，谷氨酸为第三。Ⅱ、Ⅲ两组天冬氨酸沉积率显著高于其他两组（P＜0.05）；Ⅱ组组氨酸沉积率显著高于其他三组（P＜0.05），Ⅲ、Ⅳ组间无显著差异（P＞0.05）；除这二种氨基酸外，其余所有氨基酸、总氨基酸、必需氨基酸、非必需氨基酸的沉积率Ⅱ组最高，且显著高于其他各组(P＜0.05)，而其他三组均无显著差异（P＞0.05）。

表3 饲料中添加乳酸菌和三丁酸甘油酯对克氏原螯虾肌肉氨基酸沉积率的影响（%）

2.3 饲料中添加乳酸菌和三丁酸甘油酯对克氏原螯虾肠道消化酶活性的影响（见表4）

由表4 可知，Ⅱ组各消化酶活性均为最高，且显著高于其他三组（P＜0.05）；与对照组相比，Ⅲ、Ⅳ组胃蛋白酶、α-淀粉酶活性没有显著差异（P＞0.05）；Ⅰ组胰蛋白酶活性显著低于其他三组（P＜0.05）；Ⅰ、Ⅲ组脂肪酶活性均显著低于Ⅳ组（P＜0.05）。

表4 饲料中添加乳酸菌和三丁酸甘油酯对克氏原螯虾肠道消化酶活性的影响

3 讨论

3.1 饲料中添加乳酸菌和三丁酸甘油酯对克氏原螯虾生长性能及氨基酸沉积率的影响

三丁酸甘油酯分解释放丁酸，可维持肠道完整性，促进消化酶的分泌，抑制肠道有害菌，促进肠道消化吸收，进而提高动物生产性能[7]。唐启峰等[3]研究发现，三丁酸甘油酯可显著提高南美白对虾的蛋白质效率，降低饵料系数，具有明显的促生长作用。蛋白质效率表示机体转化摄入蛋白的程度，肝体指数一定程度上反映虾蟹营养物质的储存情况[8]。本试验中，在饲料中添加0.1%三丁酸甘油酯，试验虾蛋白质效率和肝体指数与对照组相比显著降低。三丁酸甘油酯过量可能会导致肠道pH过低，损伤肠道微生态系统，减少营养物质的吸收储存，从而抑制其生长[9]。同一种酸化剂根据养殖对象的不同，发生效应的添加水平也有所差异，例如0.20%水平的三丁酸甘油酯可提高断奶仔猪生长性能和饲粮养分消化率[10]，而东方鲀添加0.1%三丁酸甘油酯时生长性能达到最高[11]。有关克氏原螯虾对三丁酸甘油酯的适宜添加量还有待进一步研究。

乳酸菌可将部分蛋白质大分子降解为小分子肽和游离氨基酸[12]，并能产生乙酸、乳酸和促生长因子，同时通过产生的抑菌物质抑制有害菌的增殖[13]，促进机体肠道消化吸化。Dash等[14]以初始质量为0.53 g的罗氏沼虾为研究对象，结果表明植物乳杆菌试验组生长性能显著优于对照组。本试验结果显示，饲料中单独添加乳酸菌能提高克氏原螯虾的生长性能和饲料利用率，这与郑晓婷等[5]的研究结果相似，乳酸菌及代谢产物进入虾的消化道辅助消化，进而促进虾的生长[15]。

水产动物的生长主要是机体蛋白质积累的过程，蛋白质的积累又是通过氨基酸的合成来实现的[16]。氨基酸还具有调节基因表达、促进小肠和骨骼肌的生长以及减少脂肪沉积等功能[17]。石泽[18]发现在建鲤饲料中添加丁酸钠对营养物质沉积率没有显著影响，这与本试验研究结果相符。在一定程度上，氨基酸沉积率可以反映饲料质量，乳酸菌发酵产生的功能性氨基酸可以形成氨基酸代谢指数的相对稳定[19]。乳酸菌添加组十七种肌肉氨基酸沉积率均显著高于对照组，这表明乳酸菌可以优化饲料氨基酸组成，提高饲料氨基酸的转化效率和沉积率。谷氨酸可转化为谷氨酰胺，反向调控蛋白质代谢，提高摄食率和生长速度[20]，亮氨酸、赖氨酸、缬氨酸等必需氨基酸参与合成机体蛋白，可促进虾类蜕壳[21]，从而促进生长。

3.2 饲料中添加乳酸菌和三丁酸甘油酯对克氏原螯虾消化酶活性的影响

动物生长与饲料利用率密切相关，而饲料利用率受到消化吸收能力的影响，消化能力又与肠道消化酶活性密切相关[22]。消化酶可加快胃肠对相应营养物质的分解利用速度，提高饲料利用率[23]，进而促进机体的生长。李雅敏等[24]研究认为，三丁酸甘油酯作为酸化剂，可有效提高草鱼肠道淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶活性。本试验结果表明，饲料中添加0.1%三丁酸甘油酯对克氏原螯虾胃蛋白酶、α-淀粉酶及脂肪酶活性影响不大，而胰蛋白酶活性显著提高。三丁酸甘油酯水解产物丁酸可以刺激结肠内水和钠离子的吸收，促进黏膜修复酶的活性[25]。

饲料营养水平可通过影响肠道形态发育和消化酶活性进而影响生长性能[26]。混合乳酸菌制剂的添加可有效减少氨态氮的产生，抑制饲料中霉菌等有害细菌的繁殖，促进饲料中有机酸的生成，更好地保留饲料营养物质[27-28]。本试验结果发现，添加乳酸菌能显著提高克氏原螯虾肠道消化酶活性，这与沙玉杰等[29]乳酸菌可以显著提高凡纳滨对虾肠道消化酶活性的研究结果一致。乳酸菌对消化道中物理、化学因素有较强的耐受性，同时代谢产生短链脂肪酸，降低肠道内容物pH，刺激增强消化器官分泌消化酶，抑或激活胃蛋白酶原，直接或间接刺激消化酶的分泌[30]。乳酸菌发酵产物乳酸在有氧的情况下可进入三羧酸循环氧化供能，进而增加肠道内消化酶活性[31]。

3.3 乳酸菌和三丁酸甘油酯的相互作用

本试验中各组成活率普遍较低，这可能与试验空间狭小导致密度过大有关。与单独添加三丁酸甘油酯组相比，混合添加乳酸菌后，增重率、肠道胃蛋白酶、胰蛋白酶及脂肪酶活性有所提高，但依然远小于乳酸菌单独添加组。同样地，同时添加乳酸菌和三丁酸甘油酯组生长性能与肌肉氨基酸沉积率没有显著提升。三丁酸甘油酯水解通过氢离子沉积降低消化道的pH[32]，乳酸菌分解产生乳酸，故乳酸菌与三丁酸甘油酯可能对肠道pH的降低起协同作用。乳酸菌最适生长的pH 为5.4 以上，肠道环境过酸，由此导致包括乳酸菌在内的有益菌生长生存受阻。此外，乳酸菌添加组的成活率略低于三丁酸甘油酯组与混合添加组，这可能是增重率略高的原因之一。

4 结论

饲料中添加乳酸菌可显著提高克氏原螯虾生长性能，促进饲料氨基酸在虾体内的沉积，单独添加三丁酸甘油酯或混合添加乳酸菌及三丁酸甘油酯未见有明显的促生长效应。乳酸菌或三丁酸甘油酯影响克氏原螯虾肠道消化酶活性，单独添加乳酸菌时效果最佳。有关克氏原螯虾乳酸菌及三丁酸甘油酯的适宜添加量还有待进一步研究。