健康成年人舌苔表象与舌苔微生态的关系

肖池，何彩红，王安鸽，谭中菊，赵新秀，廖俏云，李金优，归崎峰

1 杭州医学院基础医学与法医学院，杭州310003；2 浙江大学医学院附属第一医院老年医学科

舌苔是指覆盖在舌背面上的一层苔状物，主要由脱落的角化上皮、唾液、食物碎屑、细菌等组成。舌苔是中医舌诊的重要内容，也是中医临床辨证不可缺少的客观依据，能够反映机体内部的正邪斗争、气血盛衰、寒热虚实[1]。现阶段，舌苔形成的机制是中医现代化基础研究的一个重要方向。舌苔微生态作为一个相对完整且独立的微生态系统，因其在舌苔形成过程中具有重要作用而受到众多学者关注[2-5]。研究证实，多种疾病可导致舌苔微生态发生显著变化，而舌苔菌群变化能够为中医病证诊断提供依据[1，6]。但目前在健康人群中舌苔与舌苔微生态关系的研究较少。本研究以健康成年人为研究对象，运用高通量测序技术，观察了不同舌苔类型舌苔微生态的结构特点，旨在从微生态学角度阐释健康成年人不同舌苔类型的形成机制。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2019年6月—2020年10月在浙江大学医学院附属第一医院、绍兴市越城区斗门镇卫生院和浙江古纤道绿色纤维有限公司体检健康的成年志愿者79例。纳入标准：①身体状态良好，无任何不适症状或体征；②年龄18～59岁；③取样前1周保持正常饮食习惯；④人口学资料完整。排除标准：①合并高血压、糖尿病、高脂血症等基础疾病者；②合并HBV、HCV、HIV等病毒感染者；③有胃肠道手术史者；④合并精神疾病者；⑤取样前8周内行口腔正畸手术者，或使用益生菌、益生元、合生元及抗生素者；⑥取样前4周内做过肠道准备者。参照《中医诊断学》、《中医舌诊图谱》中舌苔分类标准，由浙江大学医学院附属第一医院一位经验丰富的中医师诊查舌苔。根据舌苔质地将研究对象分为腻苔组43例、薄苔组36例。其中，腻苔组男25例、女18例，平均年龄42岁，BMI(23.5±2.7)kg/m2，城镇人口27例、农村人口16例，有吸烟史12例，有饮酒史6例，黄腻苔22例、白腻苔21例；薄苔组男14例、女22例，平均年龄36岁，BMI(22.7±3.4)kg/m2，城镇人口28例、农村人口8例，有吸烟史7例，有饮酒史2例，薄白苔28例、薄黄苔8例。两组性别、年龄、BMI、人口来源比较差异均无统计学意义，而有吸烟史和饮酒史比例比较差异均有统计学意义。本研究由浙江大学医学院附属第一医院设计与实施，符合《赫尔辛基宣言(2013年版)》，并经医院临床研究伦理委员会批准[批件号：(2019)科研快审第(1026)号]，所有研究对象知情同意并签署书面知情同意书。

1.2 舌苔样本收集与处理 留样当日，所有研究对象于清晨空腹、不刷牙状态下，用两根无菌棉签在舌苔表面轻轻擦拭3次，将棉签头端折断后置于2 mL冻存管中，1 h内转存于-80 ℃冰箱保存。舌苔样本成批后送至北京诺禾致源科技股份有限公司检测和分析。

1.3 基因组DNA提取、PCR扩增纯化和文库构建 采用CTAB法提取样本基因组DNA，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，提取的基因组DNA纯度和浓度合格。取适量基因组DNA置于离心管中，用无菌水稀释至1 ng/μL。以稀释后的基因组DNA为模板，根据测序区域的选择，使用带barcode的特异引物，扩增区域为16sv34。引物序列：①341F：5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′；②806R：5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′。按Phusion®High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶说明进行PCR扩增。反应条件：98 ℃ 1 min，98 ℃ 10 s、50 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s共30个循环，最后72 ℃ 5 min。PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离，目的条带采用GeneJET凝胶回收试剂盒回收。采用TruSeq®DNA PCR-Free Sample Preparation Kit构建文库，经过Qubit和qPCR定量合格后，NovaSeq 6000测序系统测序。

1.4 生物信息学分析 测序数据经Reads拼接得到原始Tags数据，严格过滤处理获得高质量Clean Tags数据，然后与物种注释数据库进行比对，最终得到有效的Tags数据。利用Uparse算法对有效的Tags数据进行聚类，以97%的一致性将序列聚类成为操作分类单位(OTUs)，然后对OTUs序列进行物种注释，获得分类学信息并分别在各个分类水平上统计各样本的菌群组成，通过R软件(Version 2.15.3)构建Veen图。采用Qiime软件(Version 1.9.1)计算Chao1、ACE、Shannon、Simpson、Goods coverage和Observed species指数，然后用R软件分析α多样性指数的组间差异。采用Qiime软件计算Weighted UniFrac距离，通过R软件绘制主成分分析(PCA)图和主坐标分析(PCoA)图并评估组间的β多样性。采用线性判别分析效应值(LEfSe)软件分析LEfSe，设置线性判别分析(LDA)的筛选值为4。

2 结果

2.1 两组舌苔微生物α、β多样性分析 经高通量测序分析，79例健康成年志愿者舌苔标本中共检出2 099个OTUs。其中，腻苔组和薄苔组共享的OTUs共1 233个，腻苔组和薄苔组独有的OTUs分别为458、408个，两组OTUs比较差异无统计学意义(P>0.05)。

α多样性分析发现，腻苔组与薄苔组Chao1指数分别为345.13±82.15、349.02±88.44，ACE指数分别为348.96±82.46、352.35±91.45，Shannon指数分别为4.93±0.36、4.87±0.44，Simpson指数分别为0.93±0.02、0.92±0.04，Goods coverage指数分别为1.00±0.00、1.00±0.00，Observed species指数分别为287.33±60.02、286.58±69.80，两组上述指数比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图1。

注：TF为薄苔组，GF为腻苔组；a为Chao1指数，b为ACE指数，c为Shannon指数，d为Simpson指数，e为Goods coverage指数，f为Observed species指数。

β多样性分析发现，腻苔组与薄苔组菌群均倾向于聚集，提示两组菌群结构相似度较高。见插页Ⅰ图1。

2.2 两组差异物种分析 LEfSe分布柱状图展示了LDA>4的差异物种，其中腻苔组放线菌纲、乳杆菌目、微球菌目和链球菌科是差异物种，而薄苔组紫单胞菌科是差异物种。见插页Ⅰ图2。

进化分支图同样显示了两组间的差异物种，并且在由门至属的分类级别上揭示了差异物种的所属关系。见插页Ⅰ图3。

3 讨论

舌苔作为口腔微生物的主要定植部位，其口腔微生物的数量和种类远高于口腔其他部位。因此，舌苔微生态成为口腔微生态研究的主要对象。此外，舌苔微生态还与中医辨证施治密切相关[1]。根据张伯礼院士对6 708例健康人群舌苔类型的研究发现，健康人群舌苔类型以黄腻苔、白腻苔、薄白苔、薄黄苔最为常见，占95%以上[7]。本研究健康成年志愿者舌苔类型均为上述四种类型，与张伯礼等[7]研究结果吻合。本研究根据舌苔质地将研究对象分为腻苔组和薄苔组，然后提取舌苔样本基因组DNA，经PCR扩增纯化和文库构建后进行生物信息学分析，结果发现两组共享的OTUs共1 233个，腻苔组和薄苔组独有的OTUs分别为458、408个，两组OTUs比较差异无统计学意义；α多样性分析发现，两组Chao1、ACE、Shannon、Simpson、Goods coverage、Observed species指数比较差异均无统计学意义；β多样性分析亦显示，两组菌群均倾向于聚集，提示两组菌群结构相似度较高。结果表明健康人群的舌苔微生态相对稳定，究其原因可能与舌具有一定的自洁作用有关[8]。但本研究通过LEfSe分析发现，两组存在差异物种，其中腻苔组放线菌纲、乳杆菌目、微球菌目和链球菌科是差异物种，而薄苔组紫单胞菌科是差异物种，与既往文献[9]报道基本一致。结果表明，不同舌苔类型的菌群结构存在差异，而这些差异菌群可能在相应的舌苔类型形成过程中起重要作用。

放线菌属是人类口腔内的优势菌群之一[10]。与非吸烟者比较，吸烟者口腔放线菌门富集，相对丰度较高[11]。本研究结果发现，腻苔组放线菌纲富集明显高于薄苔组，与国内马广强等[9]研究结果一致，其原因可能与腻苔组有吸烟史比例高于薄苔组有关。国内李华等[5]研究发现，放线菌属丰度和舌苔的苔量、苔厚、苔腻呈明显正相关关系。由此推测，放线菌有可能是形成腻苔的主要微生物因素之一，并且从舌苔微生态角度上也能更好地解释吸烟可使舌苔变厚这一现象[12]。放线菌可能和人类某些疾病有一定联系。有研究报道，糖尿病患者口腔放线菌检出率明显升高，放线菌有可能增加受检者罹患糖尿病的风险[13]。此外，放线菌还可通过口腔或牙龈伤口侵入组织内部，在人体免疫力下降时易诱发慢性脓肿[14]。因此，健康人群出现腻苔可在一定程度上预示体内潜在疾病的发生风险增加。

本研究结果发现，腻苔组乳杆菌目和链球菌科丰度明显高于薄苔组。乳杆菌虽然是一种有益菌，但它也有对机体不利的一面。乳杆菌能够与口腔中的链球菌一起使糖类发酵产生乳酸或其他酸类物质，溶解牙釉质，导致龋齿、牙周炎等口腔疾病[15]。王菁等[16]对口臭患者与健康志愿者舌背微生态的菌群结构研究发现，口臭患者舌苔微生态发生了显著改变，其特有的细菌高达17种，其中链球菌检出率最高。有研究报道，口臭、牙周炎等口腔疾病与舌苔厚度呈明显正相关关系[17-18]。提示乳杆菌和链球菌可能通过口腔疾病导致腻苔形成。

本研究结果发现，薄苔组紫单胞菌科丰度明显高于腻苔组，与既往文献[9]报道基本一致。紫单胞菌科属于拟杆菌目，包括卟啉单胞菌属、巴氏菌属等，是人和动物口腔、胃肠道的正常菌群，在维持口腔微生态平衡中具有重要作用。其中，卟啉单胞菌是一种小型厌氧革兰阴性非运动球菌，作为正常菌群的一部分存在于人类口腔内，对维持口腔健康具有重要作用[9]。正常人的舌苔由于口腔微生态稳定，舌上皮细胞正常生长、分化且不存在明显炎症，这为薄白苔舌象形成奠定了基础[19]。

综上所述，健康成年人不同舌苔表象具有不同的舌苔微生态特征，其中放线菌纲、乳杆菌目、微球菌目和链球菌科是腻苔的差异物种，紫单胞菌科是薄苔的差异物种，这些菌群差异可能是不同舌苔类型形成的微生态基础。但本研究还存在一定局限性，如仅比较了薄苔和腻苔的微生态差异，对更加细化的舌苔类型未进一步探讨，中医辨证和舌苔微生态的关系亦未阐明；只评估了舌苔的微生态特征，而对两者相互作用的机制未进一步阐明；未进行吸烟、饮酒、运动、饮食等因素对舌苔及其微生态的共发生网络进行分析。