miR-191靶向调控SATB1对肝癌细胞增殖和侵袭的影响

陈红英，高贵峰，闫少茹，王春艳，王长友

1 唐山市中医医院普外科，河北唐山060300；2 唐山市人民医院骨科；3 华北理工大学附属医院普外科

肝癌是全球常见的消化系统恶性肿瘤之一。我国是肝癌的高发国家之一，尽管近年来人口标准化发病率和病死率得到显著改善，但肝癌的疾病负担仍然较重[1]。目前，肝癌的治疗方式包括手术、放化疗、靶向治疗等，但中晚期肝癌即使经积极治疗，5年生存率仍不足20%[2-3]。迄今为止，肝癌发病的确切分子机制仍不完全清楚。因此，深入探索肝癌发病的分子机制，对寻找肝癌精准治疗的新靶点具有重要意义。微小RNA(miRNA)是一类长度为19～25个核苷酸的内源性非编码小RNA分子。miRNA不仅能参与细胞增殖、分化、凋亡以及胚胎发育等正常生物学过程，其表达失衡还能参与恶性肿瘤的发生、发展[4]。miR-191是一个由22个碱基组成的非编码RNA，定位于人染色体3p21.31。有研究报道，miR-191可通过抑制表皮生长因子受体(EGFR)信号通路抑制细胞增殖；而在乳腺癌[5]、恶性脑膜瘤[6]等组织中miR-191表达下调，引起EGFR信号通路过度激活，从而促进了肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移等恶性生物学行为。特异AT序列结合蛋白1(SATB1)是一种组织特异性的核基质附着区结合蛋白，它能以独特的模式识别并结合于基质附着区，从而参与染色质重塑、组蛋白乙酰化和甲基化等修饰过程[7]。有研究发现，在食管鳞癌[8]、结直肠癌[9]等组织中SATB1过表达，并且其过表达能够激活血小板源性生长因子受体，从而促进肿瘤细胞的增殖和侵袭。近年研究发现，抑制miR-191表达可导致SATB1表达上调，从而激活Wnt信号通路，继而引起肿瘤恶性进展[10]。但目前在肝癌中miR-191与SATB1的调控关系尚不清楚。2020年4月—2021年6月，本研究探讨了miR-191靶向调控SATB1对肝癌细胞增殖和侵袭的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 人肝癌细胞系HepG2、正常肝细胞系L02(以下分别称HepG2、L02细胞)，购自美国模式菌种收集中心。引物序列、SATB1过表达质粒及其阴性对照质粒、miR-191 mimic，均由北京华大集团设计合成。7500型实时荧光定量PCR仪，购自美国ABI公司；SpectraMax L化学发光型酶标仪，购自美国Molecular Devices公司；NanoDrop 1000超微量分光光度计，购自美国Thermo Fisher Scientific公司。Vimentin、E-cadherin、N-cadherin、SATB1、Cyclin D1、p27、GAPDH单克隆抗体以及相应的二抗，购自英国Abcam公司。MTT细胞增殖检测试剂盒，购自美国Promega公司；Transwell小室，购自美国Corning公司；SYBR Green PCR Master Mix试剂盒，购自美国ABI公司；Lipofectamine2000瞬时转染试剂，购自美国Invitrogen公司；Nano-Glo®Dual-Luciferase Reporter (NanoDLRTM) Assay，购自美国Promega公司。

1.2 细胞传代培养 将HepG2、L02细胞接种于含10% FBS的RPMI 1640培养基，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱培养。待细胞融合至80%～90%时，用0.25%胰蛋白酶消化后，按1∶4传代。取传4代、对数生长期、生长状态良好的细胞用于后续实验。

1.3 miR-191、SATB1表达检测 ①miR-191、SATB1 mRNA表达：采用RT-PCR技术。取HepG2、L02细胞各1×105个，按RNeasy Plus提取试剂盒说明提取细胞总RNA，经NanoDrop 1000超微量分光光度计鉴定，提取的总RNA浓度和纯度合格，可用于后续实验。然后按逆转录试剂盒说明将总RNA逆转录为cDNA。逆转录条件：42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min。以cDNA为模板，按SYBR Green PCR Master Mix试剂盒说明进行PCR扩增。引物序列：miR-191上游引物5′-CAACGGAATCCCAAAAGCAGCTG-3′、下游引物5′-TATGGTTGTTCTGCTCTCT-3′，内参U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′、下游引物3′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-5′；SATB1上游引物5′-GATCATTTGAACGAGGCAACTCA-3′、下游引物5′-TGGACCCTTCGGATCACTCA-3′，内参GAPDH上游引物5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′、下游引物5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。PCR扩增体系共20 μL：cDNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，ddH2O 7 μL；反应条件：94 ℃ 15 s，94 ℃ 10 s、60 ℃ 35 s、72 ℃ 10 s共35个循环(miR-191)；95 ℃ 10 s，95 ℃ 40 s、62 ℃ 60 s、72 ℃ 10 s共40个循环(SATB1 mRNA)。PCR扩增反应结束，绘制熔解曲线，收集循环阈值(CT)数。分别以U6或GAPDH为内参，采用2-ΔΔCT法计算miR-191、SATB1 mRNA相对表达量。②SATB1蛋白表达：采用Western blotting法。取HepG2、L02细胞各1×105个，加入含PMSF的RIPA裂解液提取细胞核蛋白，经BCA法蛋白定量合格后，加入上样缓冲液，105 ℃金属浴15 min，SDS-PAGE分离。电泳结束，将蛋白电泳产物转印至PVDF膜上，5% BSA室温封闭2 h，然后分别加入SATB1、GAPDH一抗，4 ℃孵育过夜。次日，TBST洗膜后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h。ECL显色，暗室内显影、定影。Image J软件分析各蛋白电泳条带灰度值，以GAPDH为内参，以目的蛋白电泳条带灰度值与内参蛋白电泳条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。

1.4 miR-191和SATB1结合位点预测与验证 借助在线生物信息学软件starBase(http：//starbase.sysu.edu.cn/)和TargetScan7.2(http：//www.targetscan.org/vert_72/)预测miR-191与SATB1的结合位点。

根据突变位点分别设计SATB1野生型(WT)和突变型(MT)质粒。将HepG2细胞接种于24孔板，每孔6×104个，随机分为SATB1 WT组、SATB1 MT组、SATB1 WT+miR-191 mimic组、SATB1 MT+miR-191 mimic组。当细胞融合80%～90%时，按Lipofectamine2000瞬时转染试剂说明，SATB1 WT组转染SATB1 WT质粒、SATB1 MT组转染SATB1 MT质粒、SATB1 WT+miR-191 mimic组转染SATB1 WT质粒+miR-191 mimic、SATB1 MT+miR-191 mimic组转染SATB1 MT质粒+miR-191 mimic。转染6 h后更换培养基，继续培养48 h，收集细胞，按Nano-Glo®Dual-Luciferase Reporter (NanoDLRTM) Assay说明检测各组荧光素酶活性。

1.5 细胞转染 将HepG2细胞接种于12孔板，每孔2×105个，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱培养24 h，随机分为对照组、SATB1组、miR-191 mimic组、SATB1+miR-191 mimic组。按Lipofectamine2000瞬时转染试剂说明，对照组转染阴性对照质粒，SATB1组转染SATB1过表达质粒，miR-191 mimic组转染miR-191 mimic，SATB1+miR-191 mimic组转染SATB1过表达质粒和miR-191 mimic。转染6 h后更换培养基，继续培养48 h，收集细胞用于后续实验。

1.6 细胞增殖能力检测 将各组转染后HepG2细胞接种于96孔板，每孔1×104个，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱培养。待细胞贴壁后，分别于0、24、48、72 h加入MTT试剂20 μL，继续培养4 h，再加入DMSO 150 μL，振荡混匀，使结晶充分溶解。酶标仪于560 nm波长处检测各孔的光密度(OD)值。以OD560值代表细胞增殖活性。

1.7 细胞侵袭能力检测 将Matrigel用RPMI 1640培养基按1∶8包被Transwell小室底部膜的上室面，37 ℃下静置30 min。将各组转染后HepG2细胞重悬，制成密度为1×105/mL的细胞悬液。取细胞悬液200 μL加入Transwell小室上室，下室加入含10% FBS的RPMI 1640培养基500 μL。然后将Transwell小室置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱培养24 h，取出Transwell小室，用棉签轻轻拭去上室面未穿膜细胞，10%多聚甲醛固定30 min，0.5%结晶紫染色10 min。显微镜下随机选取5个400倍不重叠视野，计数穿膜细胞数。以穿膜细胞数代表细胞侵袭能力。

1.8 Vimentin、E-cadherin、N-cadherin、Cyclin D1、p27蛋白表达检测 将各组转染后HepG2细胞接种于6孔板，每孔2×105个，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱培养。待细胞融合80%～90%时，加入含PMSF的RIPA裂解液提取细胞核蛋白，经BCA法蛋白定量合格后，加入上样缓冲液，105 ℃金属浴15 min，SDS-PAGE分离。电泳结束，将蛋白电泳产物转印至PVDF膜上，5% BSA室温封闭2 h，然后分别加入Vimentin、E-cadherin、N-cadherin、Cyclin D1、p27、GAPDH一抗，4 ℃孵育过夜。次日，TBST洗膜后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h。ECL显色，暗室内显影、定影。Image J软件分析各蛋白电泳条带灰度值，以目的蛋白电泳条带灰度值与内参蛋白电泳条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 HepG2细胞与L02细胞miR-191、SATB1表达比较 HepG2细胞与L02细胞miR-191相对表达量分别为0.504±0.117、1.312±0.214，SATB1 mRNA相对表达量分别为1.662±0.326、0.732±0.183，SATB1蛋白相对表达量分别为0.811±0.220、0.203±0.044。HepG2细胞miR-191相对表达量低于L02细胞(t=6.440，P<0.01)，而SATB1 mRNA和蛋白相对表达量均高于L02细胞(t分别为8.125、8.130，P均<0.01)。

2.2 miR-191与SATB1的靶向调控关系 经在线生物信息学软件starBase和TargetScan7.2预测，miR-191与SATB1存在相互作用位点，见图1。SATB1 WT组、SATB1 WT+miR-191 mimic组、SATB1 MT+miR-191 mimic组及SATB1 MT组荧光素酶活性分别为3.117±0.415、1.209±0.227、3.440±0.328、3.246±0.334。SATB1 WT+miR-191 mimic组荧光素酶活性明显低于SATB1 WT组、SATB1 MT+miR-191 mimic组、SATB1 MT组(t分别为6.136、7.204、6.415，P均<0.01)。

图1 miR-191与SATB1的结合位点示意图

2.3 各组细胞增殖和侵袭能力比较 见表1。

表1 各组细胞增殖和侵袭能力比较

2.4 各组Vimentin、E-cadherin、N-cadherin、Cyclin D1、p27蛋白表达比较 见表2。

表2 各组Vimentin、E-cadherin、N-cadherin、Cyclin D1、p27蛋白相对表达量比较

3 讨论

肝癌是常见的消化系统恶性肿瘤之一。尽管近年来我国肝癌的发病率和病死率呈下降趋势，但我国人口基数大，肝癌的疾病负担仍然十分严重[11]。目前，肝癌的治疗方式包括手术、放化疗、靶向治疗等，但肝癌早期症状不典型，一旦出现典型症状就诊时，病情已进展至中晚期，治疗效果不佳，预后较差。迄今为止，肝癌发病的确切分子机制仍不完全清楚。因此，深入探索肝癌发病的分子机制，对寻找肝癌精准治疗的新靶点具有重要意义。

miRNA是一类长度为19～25个核苷酸的内源性非编码小RNA分子，由RNA聚合酶Ⅱ转录合成后被Dicer剪切形成成熟miRNA，参与形成RNA诱导的沉默复合物，识别并结合下游靶基因mRNA的3′非编码区，降低靶基因mRNA的稳定性或转录后抑制靶基因的表达。miR-191属于miRNA家族成员之一，定位于人染色体3p21.31。有研究报道，肝癌组织miR-191表达下调，其表达下调可导致Kruppel样因子6(KLF6)等下游靶基因表达异常增加，继而引起肿瘤细胞恶性增殖[12]。SHARMA等[5]研究发现，在乳腺癌细胞中miR-191表达下调，其表达下调可导致下游转录因子SOX4过表达，从而促进肿瘤细胞的侵袭和迁移。本研究结果发现，HepG2细胞miR-191表达显著低于L02细胞。提示miR-191在肝癌中可能发挥抑癌基因作用，其表达下调的原因可能与miR-191易受表观遗传学修饰调控有关。邱必军等[13]研究表明，肝癌中一些miRNA，如miR-125b、miR-191，存在过度甲基化现象，甲基化修饰可导致肝癌细胞中miR-191表达沉默。ZHOU等[10]研究发现，在肺腺癌细胞中miR-191通过与SATB1 mRNA的3′非编码区结合抑制SATB1表达，从而抑制Wnt信号通路传导，进而促进肺腺癌细胞的增殖、侵袭、迁移等恶性生物学行为。

SATB1是一种组织特异性核基质附着区结合蛋白，它能以独特的模式识别并结合于基质附着区，从而参与染色质重塑、组蛋白乙酰化和甲基化等修饰过程[7]。SATB1过表达能够促进肿瘤细胞的增殖、侵袭并抑制其凋亡，从而促进肿瘤的发生、发展[8-9]。龚丹等[14]研究表明，在肝癌组织中SATB1存在异常高表达现象，其异常高表达能够激活EGFR、血管内皮生长因子等信号通路，从而促进肝癌细胞无限增殖。本研究结果发现，与L02细胞比较，HepG2细胞SATB1 mRNA和蛋白表达均显著升高，究其原因可能与SATB1表达受miRNA(如miR-191)转录后表达调控有关。经在线生物信息学软件starBase和TargetScan7.2预测，miR-191与SATB1存在结合位点，双荧光素酶报告基因实验证实，在HepG2细胞中miR-191能够靶向抑制SATB1表达。因此，肝癌细胞SATB1表达受miR-191的靶向调控。

本研究进一步观察了miR-191/SATB1对肝癌细胞增殖和侵袭的影响，结果发现SATB1过表达能够促进HepG2细胞的增殖和侵袭能力。有研究报道，SATB1过表达能够促进下游癌基因(如EGFR)表达，抑制抑癌基因(如细胞间黏附分子)表达[14]。有研究报道，SATB1过表达可抑制肝癌细胞Hep3B、Bel-7402凋亡，而敲低SATB1表达则可抑制Hep3B、Bel-7402细胞的生长和增殖[15]。本研究还发现，SATB1过表达后，HepG2细胞增殖相关基因如Cyclin D1和上皮间质转化相关标志物N-cadherin、Vimentin表达升高，表明SATB1过表达能够通过激活Cyclin D1表达促进HepG2细胞周期转换，导致HepG2细胞恶性增殖。有研究发现，SATB1能够通过促进G1/S期转换，促进细胞周期进行，导致肿瘤细胞增殖加快[16]。SATB1能够通过上调上皮间质转化通路中的间质性标志物表达，促进HepG2细胞上皮间质转化，增强肿瘤细胞的侵袭能力。此外，HUO等[17]研究发现，SATB1能够促进p21活化激酶5(PAK5)磷酸化，PAK5激活后促进肿瘤细胞上皮间质转化，导致肿瘤细胞局部浸润和迁移。本研究利用瞬时转染技术转染miR-191 mimic促进miR-191表达，结果发现HepG2细胞增殖和侵袭能力显著降低，而转染miR-191 mimic能够逆转SATB1过表达，增强HepG2细胞的增殖和侵袭能力，进一步证实miR-191是通过靶向SATB1抑制HepG2细胞的增殖和侵袭。提示miR-191/SATB1可通过促进肿瘤细胞周期转换和上皮间质转化而发挥作用，二者有可能成为肝癌潜在的治疗靶点。

综上所述，miR-191通过靶向负调控SATB1抑制肝癌细胞的增殖和侵袭，其机制可能与miR-191/SATB1轴能够改变增殖相关蛋白Cyclin D1、p27表达以及上皮间质转化相关蛋白Vimentin、E-cadherin、N-cadherin表达有关。