CCR5基因Δ32、59029 A/G位点多态性与膝关节骨关节炎易感性的关系

赵伟，张杰

1 北京华信医院(清华大学第一附属医院)急诊科，北京100016；2 北京市平谷区医院急诊科

骨关节炎(OA)是一种常见的慢性关节疾病，多发生于中老年人群[1-2]。OA的主要临床表现为慢性疼痛、关节变形和活动受限，病理特征包括关节软骨变性、破坏或丧失，软骨下骨硬化或囊性变，关节边缘骨赘形成[3]。目前，OA的病因和发病机制尚未完全阐明[4]。单核苷酸多态性(SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸变异所引起的DNA序列多态性。有研究报道，SNP与高血压、阿尔茨海默病以及OA的发生、发展密切相关[5-7]。CC趋化因子受体5(CCR5)是一种G蛋白偶联受体，具有刺激血管生成、调节炎症细胞募集以及诱导肿瘤免疫逃逸等作用。MAGNANI等[8]研究报道，携带CCR5基因Δ32纯合突变体(Δ32/Δ32)人群前列腺癌的患病风险低于野生型和杂合突变型。近年有学者研究发现，CCR5基因SNP与炎症相关性疾病密切相关[9]，而OA是一种慢性无菌性炎症性疾病，由此推测CCR5基因SNP可能参与OA的发生、发展。但目前CCR5基因SNP与膝关节OA的关系鲜见报道。本研究探讨了CCR5基因Δ32(rs333)、59029 A/G(rs1799987)位点SNP与膝关节OA易感性的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2015年5月—2018年12月在北京华信医院就诊的原发性膝关节OA患者380例(观察组)。纳入标准：①符合原发性膝关节OA临床诊断标准；②Kellgren-Lawrence(K-L)分级≥Ⅱ级。排除标准：①既往有关节外伤或手术史者；②合并类风湿性关节炎、关节结核者；③合并心、肝、肾等重要脏器严重疾病者。其中，男232例、女148例，年龄(58.10±5.40)岁，BMI(24.16±2.44)kg/m2，有吸烟史106例，有饮酒史78例。同期随机选择在北京华信医院体检健康的志愿者380例(对照组)，男215例、女165例，年龄(56.41±4.39)岁，BMI(23.75±1.98)kg/m2，有吸烟史115例，有饮酒史90例。两组基本资料具有可比性。本研究经北京华信医院医学伦理委员会批准(批准号：HXYY_201500114)，所有研究对象或其家属知情同意并签属书面知情同意书，研究设计和实施过程符合《赫尔辛基宣言》。

1.2 CCR5基因SNP检测

1.2.1 全血基因组DNA提取 采集所有研究对象清晨空腹肘静脉血5 mL，EDTA-2K抗凝，-80 ℃超低温冰箱保存。按照人全血基因组DNA提取试剂盒说明提取基因组DNA，经NanoDrop 2000C超微量分光光度计鉴定，提取的基因组DNA合格，-20 ℃保存备用。

1.2.2 高保真PCR扩增 按照Phusion®超保真PCR Master Mix说明进行PCR扩增。所有引物序列由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。引物序列：Δ32位点上游引物5′-GCTGTCGTCCATGCTGTGTTT-3′、下游引物5′-CAACCTGTTAGAGCTACTGCAATT-3′，59029 A/G位点上游引物5′-CCCGTGAGCCCATAGTTAAAACTC-3′、下游引物5′-TCACAGGGCTTTTCAACAGTAAGG-3′。PCR扩增体系共50 μL：DNA模板1 μL，上下游引物各1.5 μL，PCR Master Mix 25 μL，灭菌水21 μL；反应条件：98 ℃预变性2 min，然后98 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s共36个循环，最后72 ℃延伸5 min。反应结束，取PCR产物4 μL进行2%琼脂糖凝胶电泳(140 V 15 min)，紫外凝胶成像系统拍照观察。

1.2.3 Sanger-DNA测序 将PCR扩增产物送至上海生工生物工程股份有限公司测序。产物经纯化后，加入10 μL Hi-Di Formamida充分溶解，95 ℃变性5 min后迅速置于冰水中冷却4 min，变性产物置于3500dx测序仪分析。根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳，从而获得可见的DNA碱基序列，最后经Chromas软件(v2.6.5)分析。

2 结果

2.1 CCR5基因Δ32、59029 A/G位点基因型分析 CCR5基因Δ32位点PCR产物长度为441 bp，59029 A/G位点PCR产物长度为268 bp，见图1A。CCR5基因Δ32位点存在3种基因型，分别为Wt/Wt、Wt/Δ32、Δ32/Δ32，见图1B；CCR5基因59029 A/G位点存在3种基因型，分别为AA、AG、GG，见图1C。

注：A为PCR跑胶结果，B为CCR5基因Δ32位点基因型测序结果，C为CCR5基因59029 A/G位点基因型测序结果。

2.2 两组CCR5基因Δ32位点基因型和等位基因分布比较 两组CCR5基因Δ32位点基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，具有群体代表性。两组CCR5基因Δ32位点Wt/Wt、Wt/Δ32、Δ32/Δ32基因型分布以及Wt、Δ32等位基因分布比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 两组CCR5基因Δ32位点基因型和等位基因分布比较

2.3 两组CCR5基因59029 A/G位点基因型和等位基因分布比较 两组CCR5基因59029 A/G位点基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，具有群体代表性。两组CCR5基因59029 A/G位点AA、GG基因型分布以及A、G等位基因分布比较差异均有统计学意义(P均<0.05)，而AG基因型分布比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 两组CCR5基因59029 A/G位点基因型和等位基因分布比较

2.4 两组CCR5基因单体型分析 两组CCR5基因Wt-A、Wt-G、Δ32-A单体型频率比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，而两组CCR5基因Δ32-G单体型频率比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 两组CCR5基因单体型频率比较[频数(%)]

3 讨论

近年来，随着我国人口老龄化加剧和生活方式转变，膝关节OA的发病率不断上升，已成为导致我国60岁以上男性丧失劳动能力的主要原因之一。但目前膝关节OA的病因和发病机制尚未完全阐明，仍需进一步探索，以期为膝关节OA的防治提供依据。

SNP是人类基因组DNA中最常见、最稳定的基因变异。近年来，越来越多学者研究发现某些基因SNP与OA的易感性密切相关[10]。例如，YANG等[11]研究发现，SMAD家族成员3基因rs12901499位点多态性能够增加OA的发病风险；ZHANG等[12]研究报道，mutY DNA糖基化酶基因rs3219463位点G等位基因携带者和ORAI钙释放活化钙调节剂1基因rs7135617位点T等位基因携带者OA的发病风险明显升高；CEKIN等[13]研究认为，叉状头转录因子3基因rs3761548位点多态性与土耳其人OA的发病风险增加有关。此外，TANG等[14]通过荟萃分析发现，Toll样受体10基因多态性与髋关节OA的易感性密切相关。以上研究结果表明，某些基因SNP在OA的发病过程中可能扮演重要角色。

CCR5是一种G蛋白偶联受体，作为趋化因子受体，能够调节记忆或效应T细胞、巨噬细胞、未成熟树突状细胞和自然杀伤细胞的运输和效应功能[15]。CCR5基因能够与趋化因子配体3(CCL3)、CCL4和CCL5结合，通过G蛋白偶联发挥作用。既往研究证实，CCR5通过PKCδ/c-Src/c-Jun和AP-1信号通路增加人OA滑膜成纤维细胞中IL-6产生，加剧疾病进展[16]。Δ32位点(chr3：46373453-46373487)位于CCR5基因开放阅读框，59029 A/G位点(chr3：46370444)位于CCR5基因启动子区域，这两个位点是CCR5基因最常见的SNP。有研究发现，CCR5基因Δ32位点SNP与自身免疫性疾病和神经退行性疾病密切相关[17-18]。SMOLEN-DZIRBA等[19]研究报道，CCR5基因Δ32位点Δ32/Δ32基因型可能在HIV-1感染中具有保护作用，尤其对于未感染HIV-1人群。MATOS等[20]研究认为，CCR5基因Δ32位点SNP与巴西甲型H1N1流感的严重程度和病死率有一定关系。DROZD-DABROWSKA等[21]研究发现，CCR5基因Δ32位点SNP具有抵抗HBV感染及加速HBV感染恢复的能力。最近，KESHAVARZI等[22]研究发现，CCR5基因59029 A/G位点AA基因型与2型糖尿病的发病密切相关，而AG、GG基因型与2型糖尿病的发病无关。这些研究结果表明，CCR5基因SNP与炎症相关性疾病的发生密切相关。而OA是一种慢性无菌性炎症性疾病，由此推测CCR5基因SNP可能参与OA的发生、发展。但目前CCR5基因SNP与膝关节OA的关系鲜见报道。

本研究结果发现，观察组CCR5基因Δ32位点Wt/Wt、Wt/Δ32、Δ32/Δ32基因型分布以及Wt、Δ32等位基因分布与对照组比较差异均无统计学意义，提示CCR5基因Δ32位点SNP与膝关节OA的发生无关。本研究结果发现，观察组CCR5基因59029 A/G位点AA、GG基因型分布以及A、G等位基因分布与对照组比较差异均有统计学意义，提示CCR5基因59029 A/G位点SNP与膝关节OA的发生有关。单体型是个体组织中完全遗传自父母双方中一个亲本的一组等位基因，又叫单倍体型或单元型。基于单体型的分析方法在OA的研究中越来越受到重视。本研究结果发现，观察组CCR5基因Δ32-G单体型频率与对照组比较差异有统计学意义，而CCR5基因Wt-A、Wt-G、Δ32-A单体型频率与对照组比较差异均无统计学意义，提示CCR5基因Δ32-G单体型与膝关节OA的发生有关。

综上所述，CCR5基因Δ32位点SNP与膝关节OA的发生无关，而59029 A/G位点SNP与膝关节OA的发生有关，携带GG基因型或Δ32-G单体型者膝关节OA的发生风险明显增加。但由于本研究样本量有限，其结论仍需多中心、大样本量进一步验证。