反硝化产碱菌Alcaligenes sp.TB氧化亚氮还原酶基因的克隆表达及酶学性质研究

夏筱媛，顾思扬

(1.湖州学院 生命科学系，浙江 湖州 313000；2.湖州生态环境监测中心，浙江 湖州 313000)

随着全球气候的日益变暖，调控温室气体的排放变得十分必要而且紧迫。除了CO2和CH4以外，N2O是另一种重要的温室气体[1]。据报道，大气中N2O的体积分数每增加一倍，全球地表气温将上升约0.4 ℃，其增温潜能是CO2的190～270倍，CH4的4～21倍，对全球温室效应的贡献约占6%，预计将来可能达到10%[2-3]。同时，N2O的大量排放还会造成严重的臭氧层空洞致使人类患皮肤类疾病的风险骤然增高[4]。因此，消除和控制N2O成为了一项迫在眉睫的工作。

好氧反硝化菌的发现为生物脱氮技术提供了一个崭新的思路。好氧脱氮技术具有以下优点：①硝化/反硝化反应在同一个反应器中进行可节约成本并缩短处理周期；②好氧反硝化菌更易控制；③硝化的产物可直接作为反硝化作用的底物，避免了硝酸、亚硝酸的积累对硝化反应的抑制，加速了硝化-反硝化进程[5]。

图1 反硝化功能酶和功能基因

根据氧化还原特性和光谱学分析可将氧化亚氮还原酶分为purple型和pink型[7-8]。氧化亚氮还原酶的每个亚基都包含6个Cu原子，它们排列成2个不同类型的活性中心，一个是双核电子传递位点CuA，另一个是四核催化位点CuZ[9]。氧化亚氮还原酶是一种可溶性蛋白，能在低氧或缺氧条件下表达，但易受低pH的抑制。同时，它对氧浓度也比较敏感，低DO条件下取代N2成为反硝化的终产物，但只要获得电子，N2O还原反应就不受氧的影响[10]。有氧条件下，一些好氧反硝化菌如T.pantotropha的氧化亚氮还原酶能将NO、N2O两种气体同时还原，这与厌氧反硝化菌的氧化亚氮还原酶相似[11]。有学者在一株施氏假单胞菌的染色体上鉴定了6个氧化亚氮还原酶基因，分别为nosL，nosY，nosF，nosD，nosZ，nosR，分别编码190，276，308，396，637和725个氨基酸的蛋白[12]。这些基因组成长度为7924 bp的氧化亚氮还原酶类基因簇，基因之间排列紧密。研究表明，在P.stutzeriA1501，P.aeruginosaPA01，P.fluorescens等细菌中，Nos基因簇都是由上述6个基因组成[7,9,13-15]，而且在染色体上的排列顺序和转录方向也完全一致。在反硝化酶系中，Nor，Nir和Nos基因簇按照一定顺序在染色体上相邻排列，形成岛状区域。

关于nosZ基因的调节规律还未被详细探究，且Nos基因的表达也被证明仅能由N2O诱发。本文以实验室筛选得到的菌株AlcaligenesdenitrificansTB作为实验菌种，研究氧化亚氮还原酶基因在大肠杆菌中的表达及其酶学性质。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1菌种与质粒

实验室从污水处理厂活性污泥中筛选得到一株好氧反硝化菌菌株反硝化产碱菌(A.denitrificans)YS，经过紫外诱变得到一株反硝化能力更强的突变菌株TB(GenBank No.JQ044686)，保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC No.M2011368)。菌株TB为革兰氏阴性菌，呈杆状，菌落颜色为白色，菌落呈小型单个菌落，凸起，不透明，表面光滑，边缘整齐[16]。

大肠杆菌E.coliBL21(DE3)与质粒pGEM-T和pET28b购于生工生物工程(上海)有限公司。

1.1.2培养基与贮存液

LB培养基：蛋白胨10 g·L-1，酵母抽提物5g·L-1，氯化钠10 g·L-1，pH 7.0。

用无菌水分别配备50 mg·mL-1卡那霉素(Kan)、100 mg·mL-1氨苄青霉素(Amp)、240 mg·mL-1的诱导剂(IPTG)母液，用0.22 μmmol·L-1无菌滤膜除菌后于-20℃分管保存。

50×TAE电泳缓冲液：Tris base 60.5 g，Na2EDTA·2H2O 9.3 g，冰醋酸14.275 mL，用去离子水定容至250 mL容量瓶，经超声清洗仪超声全部溶解后，室温保存备用。

1×TAE电泳缓冲液：在250 mL容量瓶中添加5 mL 50×TAE，再用超纯水定容至250 mL。

0.9%琼脂糖凝胶：1×TAE电泳缓冲液100 mL，琼脂糖0.9 g，微波炉反复加热至完全溶解。

1.2 方法

1.2.1构建重组工程菌E.coliBL21(DE3)-pET28b-nosZ

细菌总DNA提取按照细菌基因组DNA提取试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)使用说明进行。从NCBI获得反硝化无色杆菌AchromobacterdenitrificansNBRC 15125 (NZ_BCTQ01000008)基因组中氧化亚氮还原酶序列，设计引物进行PCR(引物序列：GW003-NF ATGTCCGACAAGAATCCCGA;GW003-NR CTACGCGGTCTTCTTCGGGT)。构建重组质粒pET28b-nosZ，再转入大肠杆菌感受态细胞，获得经过鉴定含重组质粒pET28b-nosZ的重组工程菌。

图2 重组质粒pET28b-nosZ

1.2.2重组蛋白诱导条件的优化

为了确定重组菌的最佳诱导表达温度，将其接入10 mL含有卡那抗性的LB试管中，培养过夜，作为种子液，接种2%种子液至100 mL LB培养基中，加入100 μL卡那霉素(终浓度50 μg·mL-1)，摇床转速150 r·min-1，37 ℃培养至OD600达到0.6～0.8(约3～4 h)，加入0.5 mmol·L-1IPTG，分别在25，28，30，33，37 ℃诱导6 h左右，在4 ℃，12 000 r·min-1离心10 min收集菌体，按比例1.0 g菌体重悬于5 mL浓度为20 mmol·L-1Tris-HCl缓冲液中，超声波进行细胞破碎(功率200 W，工作5 s，间歇10 s，破碎100次)。4 ℃，12 000 r·min-1高速离心后取上清液，通过SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳确定最佳诱导温度。

确定最佳诱导温度后，设置终浓度0.2，0.5，1.0，1.5，2.0，3.0 mmol·L-16种不同浓度IPTG进行优化。分别设置2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0 h 6个不同条件的诱导时间进行优化。最后，同样考察不同初始菌体浓度(OD600=0.35～1.37)对重组大肠杆菌生长和产酶的影响。

1.2.3氧化亚氮还原酶酶学性质研究

同上述1.2.2的方法制得粗酶液。粗酶液用0.45 μm的水系过滤后，保存在充满氦气的西林瓶中。

酶活检测方法由文献改进[17-19]，具体步骤如下：吸取20 mmol·L-1Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)1.5 mL、10 mmol·L-1还原型甲基紫精溶液0.2 mL、酶液0.1 mL，再加入50 mmol·L-1的连二亚硫酸钠溶液形成蓝色中间体，此混合反应液在600 nm处的吸光值(A600)保持在1.0～1.2，注入0.1 mL的N2O饱和溶液，在氧化亚氮还原酶的催化作用下，甲基紫精与连二亚硫酸钠的蓝色中间体作为电子供体向N2O提供还原性电子，褪去蓝色，混合溶液的A600值逐渐降低，A600斜率降低幅度反映了N2OR酶催化反应的速率，分光光度计记录加入前1 min至加入后4 min这5 min内A600的变化(每隔10 s测量一次)，绘制A600值的变化曲线，并计算斜率。

前1 min内的曲线斜率在-0.02～0.01为有效数据，后4 min的斜率为这段时间的平均斜率，在数值上定义，酶活力(U)=△y/底物摩尔消光系数。N2O饱和溶液采用N2O气体向双蒸水中持续鼓泡0.5 h的方法获得。甲基紫精的消光系数为11.4 mmol·L-1·cm-1。

1.2.4氧化亚氮还原酶蛋白质谱分析

分别取野生菌与重组菌菌体样品送至北京安必奇生物公司进行蛋白混合液LC-MSMS质谱检测分析。样品经溶液蛋白酶解、胶内蛋白酶切后将分离的肽段进入质谱仪Thermo Scientific Q Exactive进行在线检测，定量测定两株菌中氧化亚氮还原酶蛋白的相对含量。

1.2.5酶的提取纯化

采用His标签可溶性蛋白纯化试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)对氧化亚氮还原酶进行提取纯化。

1.2.6酶催化条件优化

对本试验所用比色皿进行密封和充He处理，向反应液加1.5 mL 20 mmol·L-1Tris-HCl缓冲液、0.2 mL 10 mmol·L-1还原型甲基紫精溶液，0.1 mL氧化亚氮还原酶纯酶液，50 μL 50 mmol·L-1现配连二亚硫酸钠溶液[20]。轻微振荡摇匀后，用微量注射器注入0.1 mL的N2O饱和溶液启动酶催化反应，测定4 min反应前后600 nm处的吸光值。以酶活最高的作为标准(即相对酶活为100%)，对各个条件下的酶活进行比较。

分别对反应温度(30，35，40，45和50 ℃)以及反应体系pH(5.0，6.0，7.0，8.0，9.0和10.0)对酶活的影响进行了考察，并确定最佳反应温度和pH。

2 结果与分析

2.1 氧化亚氮还原酶基因序列分析

运用DNAMAN软件分析核酸序列的分子量、碱基组成和碱基分布。氧化亚氮还原酶核酸序列的分析结果为：碱基组成为A 405，C 656，G 589，T 267；百分比分别为A 21.13%，C 34.22%，G 30.73%，T 13.93%。分子量为：ssDNA 588.2 kDa，dsDNA 1170.3 kDa。氨基酸个数为639。

2.2 菌落PCR检测阳性克隆

氧化亚氮还原酶基因的PCR产物经纯化后，序列经密码子优化及合成，再连接至pGEM-T载体，然后用XbaI和XhoI双酶切，回收1900 bp左右的DNA片段；用XbaI和XhoI对pET28b进行双酶切，回收5600 bp的片段；将这两种片段相连接，构建目的重组质粒pET28b-nosZ，转化入E.coliBL21(DE3)，结果见图3。

图3 菌落PCR琼脂糖凝胶电泳图

2.3 重组蛋白诱导条件的优化

将目的基因成功插入表达载体pET28b中，通过转化至大肠杆菌BL21(DE3)，用IPTG诱导表达，超声破碎的上清液和沉淀用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其表达情况。如图4结果显示，在经密码子优化之后，nosZ基因得到了高效表达，在70 kDa附近检测到目的条带，为可溶目的蛋白且包涵体较少。

M:蛋白Marker；1:未经IPTG诱导的裂解菌液上清；2:未经IPTG诱导的裂解菌液沉淀；3:经过IPTG诱导的裂解菌液上清；4:经过IPTG诱导的裂解菌液沉淀。图4 重组蛋白SDS-PAGE分析

2.3.1诱导剂浓度对菌体生长和产酶的影响

发酵液中诱导剂的浓度对菌体的生长和产酶均有重要影响。IPTG与阻遏蛋白结合形成复合物，使阻遏蛋白构象发生改变，从而促进目的基因的表达。IPTG的用量不仅影响菌体的生长和蛋白的表达，还影响蛋白能否在表达中正确的折叠，减少包涵体的形成[21]。

M:蛋白Marker；1:0.2 mmol·L-1；2:0.5 mmol·L-1；3:1.0 mmol·L-1；4:1.5 mmol·L-1；5:2.0 mmol·L-1；6:3.0 mmol·L-1。图5 诱导剂浓度对nosZ诱导表达的影响

本试验中，设置IPTG浓度为0.2，0.5，1.0，1.5，2.0，3.0 mmol·L-1，然后测定其菌体生长和蛋白含量。从图5中可以看出，当IPTG浓度为0.5 mmol·L-1时，目的条带最明显，且多为可溶蛋白。当诱导剂浓度大于5 mmol·L-1时，诱导表达量逐渐降低。在图6中，当诱导剂浓度较低时，酶活处于较高水平，在IPTG浓度为0.5 mmol·L-1时达到最大；当IPTG浓度过高，产酶开始下降。对菌体生长而言，菌体浓度随着IPTG浓度的上升而持续下降，这主要是因为IPTG对细胞具有毒性作用。这一现象可能是由于在IPTG浓度较低时，菌体生长量较大但IPTG诱导能力不够，而IPTG浓度较高时又会抑制菌体的生长。

图6 诱导剂浓度对菌体生长和产酶的影响

2.3.2诱导温度对菌体生长和产酶的影响

诱导表达温度过高，重组蛋白合成速率太高，可能会影响功能蛋白的正确折叠从而影响活性[22]，但培养温度过低会抑制复制、转录和翻译的水平，还会影响菌体的生长速度，导致生物量的减少，同样不利于蛋白的表达[23]。因此要选择合适的诱导温度，在两者间找到一个平衡点。

本文考察了不同诱导温度(25，28，30，33和37 ℃)对E.coliBL21(DE3)-pET28b-nosZ的生长和产酶的影响。从图7可以看出，重组蛋白在25～37 ℃条件下都能得到表达。对菌体生长而言，菌体的生物量随着温度的上升而增加，说明温度的提高有利于菌体更好地生长。同时，诱导温度对产酶也有显著影响，温度为28 ℃时，产酶量最大，但温度过高不利于目的蛋白的表达(见图8)。随着温度的升高，产酶量急剧下降，这可能是由于较高的温度增加了热变性的作用，在细胞内容易形成不溶性的包涵体，从而导致产酶量下降。

M:蛋白Marker；1:25 ℃；2:28 ℃；3:30 ℃；4:33 ℃；5:37 ℃。图7 诱导温度对nosZ诱导表达的影响

图8 诱导温度对菌体生长和产酶的影响

2.3.3诱导时间对菌体生长和产酶的影响

诱导剂对菌体生长有一定的阻碍作用，因此，不同的诱导时间对菌体生长和酶活力都有较大的影响。本研究选择IPTG浓度0.5 mmol·L-1，诱导温度为28 ℃，在诱导2，3，4，5，6，7 h后分别取样收集菌体，考察诱导时间对菌体生长和产酶的影响。结果如图9和图10所示，目的蛋白的表达量起初随着诱导时间逐渐增加，但在6 h时得到最明显的条带。随着诱导时间的延长，菌体量持续增加。这是因为菌体处于生长期，培养时间越长，菌体生长量越大。产酶量随着诱导时间的增加总体呈增长趋势，但在6 h达到最大，诱导时间继续延长，总酶活开始略有下降，这可能是由于过长时间的诱导导致目标蛋白形成包涵体或者目标蛋白被逐渐降解。并且，细菌生长至稳定期之后，由于培养体系营养消耗殆尽导致菌体衰老、自溶，此时进一步延长诱导时间，可能会引起重组蛋白水解、变性等问题[24]。因此，选取6 h为最佳诱导时长。

M:蛋白Marker；1:2 h；2:3 h；3:4 h；4:5 h；5:6 h；6:7 h。图9 诱导时间对nosZ诱导表达的影响

图10 诱导时间对菌体生长和产酶的影响

2.3.4初始菌体浓度对菌体生长和产酶的影响

诱导初始的菌体浓度是影响蛋白表达的重要参数。当诱导剂添加过早，初始菌体浓度太低，会对生长细胞造成毒性，生物量和目的蛋白产量都会降低；而当诱导剂添加太晚，菌体浓度过高会使得培养基中营养物质过度消耗，从而影响产酶速率[25]。

图11反映不同初始菌体浓度的培养体系中，加入IPTG至终浓度为0.5 mmol·L-1，28 ℃下诱导6 h后采集样品进行电泳分析的结果。可以看出在OD600为0.51和0.67时目的条带最明显，且菌体浓度过低和过高的情况下蛋白表达都较低。如图12结果显示，菌体浓度随着初始浓度的增大而增大，并在OD600>1.20时趋于稳定。说明在培养基营养充足时，较高的菌体浓度利于目的蛋白的表达。另外对于产酶而言，在OD600=0.67时添加诱导剂总酶活达到最大值，OD600值继续增加酶活显著下降。可见初始菌体浓度过大会影响蛋白活性，诱导剂添加的时机对于外源蛋白的表达效果具有显著影响。

M:蛋白Marker；1:0.35；2:0.51；3:0.67；4:0.88；5:1.20；6:1.37。图11 初始菌体浓度对nosZ诱导表达的影响

图12 初始菌体浓度对菌体生长和产酶的影响

2.4 重组菌氧化亚氮还原酶活性检测及蛋白质谱检测

通过以发酵后收集的静息细胞进行酶活力检测来确定重组菌E.coliBL21(DE3)-pET28b-nosZ所表达的目的蛋白是否具有氧化亚氮还原酶活力。如图13及表1显示，重组菌E.coliBL21(DE3)-pET28b-nosZ酶活力约是出发菌株Alcaligenessp.TB的2.09倍，而空白对照组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)没有检测到酶活，表明重组菌E.coliBL21(DE3)-pET28b-nosZ构建成功，并且在E.coliBL21(DE3)中被高效表达。另外，重组菌和出发菌的培养液中无酶活，说明氧化亚氮还原酶是胞内表达。

●表示Alcaligenes sp.TB；■表示E.coli BL21(DE3)-pET28b-nosZ；▲表示空白对照。图13 测定N2OR酶活时A600的变化

通过对重组菌和出发菌蛋白混合液LC-MSMS质谱检测分析，定量测定两株菌中氧化亚氮还原酶蛋白的相对含量。如表1的结果显示，重组菌E.coliBL21(DE3)-pET28b-nosZ蛋白混合液中氧化亚氮还原酶蛋白相对含量是出发菌株Alcaligenessp.TB的10.58倍，说明重组菌中氧化亚氮还原酶蛋白的产酶效率较出发菌有大幅提升，利于得到更多的目的蛋白。

表1 氧化亚氮还原酶活性及蛋白含量检测

2.5 氧化亚氮还原酶的分离纯化

通过对诱导表达条件的优化，取0.5 mmol·L-1IPTG浓度，初始菌体浓度约为0.67，28 ℃和6 h作为最佳条件，将E.coliBL21(DE3)-pET28b-nosZ接种于LB培养基，发酵收集菌体。菌体破碎后通过Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒(可溶性蛋白)进行提取纯化，分别取重组细胞，破碎上清液和纯化的氧化亚氮还原酶进行SDS-PAGE分析，结果如图14显示，E.coliBL21(DE3)-pET28b-nosZ成功表达了氧化亚氮还原酶nosZ，并通过纯化在第6泳道获得了大小约为70 kDa的单一条带，其大小与理论分子量相符，说明nosZ基因得到高效表达且纯化效果良好。

M:蛋白Marker；1:未经IPTG诱导的菌体总蛋白；2:未经IPTG诱导的蛋白流穿液；3:未经IPTG诱导的蛋白洗脱液；4:经过IPTG诱导的菌体总蛋白；5:经过IPTG诱导的蛋白流穿液；6:经过IPTG诱导的蛋白洗脱液。图14 SDS-PAGE验证氧化亚氮还原酶蛋白

2.6 反应温度及pH对酶活的影响

由于适宜的反应温度对酶催化反应至关重要，本文考察了不同温度下氧化亚氮还原酶催化反应的影响，图15代表在30，35，40，45 和50 ℃条件下检测氧化亚氮还原酶和底物作用情况。结果显示，温度较低时，酶活力随温度上升较快，最大酶活在40～45 ℃区间，温度过高或者过低都会影响氧化亚氮还原酶的酶活。后续的试验以40 ℃作为反应温度。

图15 反应温度对酶活的影响

考察了不同pH对酶催化反应的影响。结果如图16所示，在40 ℃下分别于pH为5.0，6.0，7.0，8.0，9.0和10.0条件时，检测酶与底物作用情况。当pH为7.0时，酶的活力最大，且在偏碱性条件下活力较好。pH过高或者低于6.0都会引起酶活的明显降低。

图16 反应体系pH对酶活的影响

3 结论

N2O是一种重要的温室气体，对全球温室效应的贡献非常显著。研究发现在反硝化细菌中存在氧化亚氮还原酶能将其最终还原成氮气。因此，对于氧化亚氮还原酶基因研究意义重大。本文将AlcaligenesdenitrificansTB中的nosZ基因成功克隆到原核表达载体上并成功构建重组工程菌BL21(DE3)-pET28b-nosZ。将重组菌在IPTG诱导下表达并对诱导条件进行优化，然后对比分析重组菌与工程菌的酶活及蛋白相对含量。粗酶液经镍亲和层析纯化得到纯度较高的目的蛋白，并对该蛋白酶学性质进行了研究。主要结论有：用XbaI和XhoI双酶切将目的片段连接到表达载体pET28b上，再转化至大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中成功构建重组质粒pET28b-nosZ；利用IPTG成功诱导得到目的蛋白，得到最佳诱导条件为：诱导剂IPTG终浓度为0.5 mmol·L-1，诱导温度为28 ℃，诱导时间为6 h，菌体初始浓度(OD600)为0.67；超声波法得到含有目的蛋白的粗酶液并通过His标签蛋白纯化试剂盒经镍亲和层析纯化得到纯度较高的氧化亚氮还原酶蛋白，SDS-PAGE电泳检测得到该蛋白大小约为70 kDa；通过检测显示重组菌E.coliBL21(DE3)-pET28b-nosZ与出发菌株Alcaligenessp.TB相比，酶活是其2.09倍，以及蛋白相对含量是其10.58倍；在酶催化反应中，当pH为7.0，温度为40 ℃时得到最佳酶活。