1 株圆环病毒3 型美国毒株全基因组克隆与遗传演化分析

郑 晶，郝桂英，谢 礼，安 微，杨 苗，陈瑛琪，张 婧，郑 巧，陈 溪，陈孝宇，林 华

（1.成都海关技术中心，四川省食品安全检测重点实验室，四川成都 610041；2.西昌学院动物科学学院，四川西昌 615013；3.大连海关技术中心，辽宁大连 116014；4.武汉海关技术中心，湖北武汉 430010）

猪圆环病毒（porcine circovirus，PCV）是一种小型、无囊膜、单股负链环状DNA 病毒[1]，属于圆环病毒科、圆环病毒属[2]，是已知最小的病毒之一。该病毒能在猪和其他动物中引起广泛疾病[3-4]。目前在已有报道中，根据抗原性和基因型的不同，其可分为PCV1[5]、PCV2[6]、PCV3[7]和PCV4[8]3 个血清型。PCV3 可引起猪的皮炎肾病综合征、繁殖障碍以及心脏和多系统的炎症反应。PCV3 感染后，患病母猪受孕率降低，流产率增加，可出现产死胎或木乃伊胎现象；患病仔猪出现多器官系统功能紊乱[9]。2016 年美国首次报道发现PCV3，随后波兰[10]、韩国[11]、中国[12]及意大利[13]等国家也相继报道。PCV3 在世界范围内迅速扩散，引起了各国高度重视和密切关注。

PCV3 全基因组长度约2 000 bp，包含11 个可能的开放阅读框（ORF1—ORF11）。其中有3 个主要的开放阅读框：ORF1 编码由297 个氨基酸（aa）组成的复制酶蛋白Rep，ORF2 编码由214 个aa 组成的衣壳蛋白Cap，ORF3 编码由231 个aa 组成的功能未知蛋白质[7]。目前，国际上尚无普遍公认的PCV3 亚型分类规则。大部分学者根据基因组DNA全长序列差异，将PCV3分为两个亚型（PCV3a和PCV3b）[14]；也有学者根据Cap 蛋白存在的两个氨基酸突变（A24V 和R27K）不同，将PCV3分为3 个亚型（PCV3a、PCV3b 和PCV3c）[15-16]。根据现有流行病学报道，中国[17]、印度[18]、越南[19]、泰国[20]及美国[14]等主要流行PCV3a、PCV3b 两个亚型，其他国家或地区对PCV3 不同亚型的流行情况鲜有报道。本研究通过对染病的美国种猪采集组织样品进行多种病原核酸扩增，确认病料组织PCV3 阳性，然后扩增PCV3 全基因组，并将其与GenBank 上不同地区PCV3 参考毒株全基因组序列进行遗传进化比对分析，根据基因组差异进行分型，以期了解该序列与不同地区PCV3 毒株的遗传进化关系，为PCV3 分子流行病学研究及防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品 2021 年4 月，四川省某企业进口美国种猪中发现疑似染疫猪，临床表现为进行性消瘦、呼吸困难、皮肤苍白。对死亡猪采集肺脏、脾脏、淋巴结及小肠等组织样品，放置于-70 ℃保存备用。

1.1.2 主要试剂 MagMAXTMCORE NucleicAcid Purification Kit 核酸提取试剂盒，购自赛默飞世尔科技公司；2×HotStartTaqplus Master Mix（Quick Load）、ddH2O，购自近岸蛋白质科技有限公司；大肠杆菌DH5α、pMD18-T 载体、DL5 000 DNA Marker、DNA 胶回收试剂盒，购自宝生物工程（大连）有限公司；氨苄青霉素（ampicillin）、Trans2K DNA Marker、6×loading buffer，购自北京全式金生物技术有限公司；胰蛋白胨（tryptone）和酵母提取物（Yeast Extract），购自英国Oxoid公司；氯化钠、氢氧化钠、琼脂糖（agarose），购自西班牙BIOWEST 公司。

1.1.3 引物设计与合成 参考GenBank 中收录的PCV3 美国株（GenBank 登录号：MK496297.1）全基因组序列，分别设计合成用于扩增PCV3 全基因组的2 对引物（表1）。引物由擎科生物（成都）科技有限公司合成。

表1 引物序列

1.2 样品处理及RNA/DNA 提取

无菌条件下将采集的病死猪肺脏、脾脏、淋巴结等组织研磨搅碎，按照MagMAXTMCORE NucleicAcid Purification Kit 核酸提取试剂盒说明书，从病料组织中提取基因组。

1.3 病原检测

按照相关标准[21-30]对病死猪组织分别进行猪细小病毒（PPV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪Delta 冠状病毒（PDCoV）、塞内卡病毒（SVV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪劳森氏胞内菌（PPE）、猪支原体肺炎（M.HYO）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、PCV2及PCV3检测。

1.4 PCV3 基因组扩增

以检出PCV3 阳性的组织DNA 为模板，用已设计的2 对引物分别进行PCV3 基因组序列扩增。反应体系为25.0 μL：2×TaqMaster Mix 12.5 μL、模板DNA 2.0 μL、上游引物1.0 μL、下游引物1.0 μL、ddH2O 8.5 μL。反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，28 个循环；72 ℃延伸5 min。取5.0 μL 扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，观察结果。

使用DNA 回收试剂盒对与预期大小相符的2条片段进行胶回收，并分别与pMD18-T 载体4 ℃连接过夜；连接产物转化至E.coliDH5α 感受态细胞，取100 μL 均匀涂布至含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基，37 ℃培养12～16 h；挑选单个阳性克隆菌落接种于含氨苄青霉素的LB 液体培养基，37 ℃振荡培养12 h，进行菌液PCR 鉴定。

1.5 PCV3 全基因组核苷酸序列比对与遗传进化分析

使用质粒提取试剂盒对阳性克隆菌液提取质粒，将酶切（EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ）正确的重组质粒送擎科生物（成都）科技有限公司测序；对扩增产物大小约1 200 和1 100 bp 的核苷酸序列进行拼接，获得PCV3 全基因组序列，并与国内外38 个PCV3 参考毒株（表2）通过BLAST 在线进行核苷酸同源性比对；同时，用生物信息学软件进行遗传进化分析，采用Neighbor-Joining（NJ）法（1 000 次重复bootstrap 分析）生成系统进化树。

表2 PCV3 参考毒株全基因组序列信息

1.6 PCV3 毒株ORF1、ORF2 核苷酸序列及推导的氨基酸序列分析

用生物信息学软件分别将获得的美国毒株PCV3 ORF1 和ORF2 基因序列及推导的氨基酸序列与国内外38 个毒株进行比对分析。

2 结果与分析

2.1 病原检测

对病死猪组织分别进行PPV等9种病原检测，结果显示，仅检出PCV3 阳性。

2.2 PCV3 全基因组扩增

将PCV3 全基因组扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，分别在约1 200 和1 100 bp 处出现扩增条带，其大小与预期基本相符（图1）。通过测序拼接后，获得全长约为2 000 bp 的PCV3 全基因组序列。

2.3 PCV3 毒株全基因组核苷酸序列比对与遗传进化分析

将获得的PCV3 美国毒株命名为PCV3_USA2021（Genbank 登录号：OL799306）。其与国内外38 个毒株核苷酸同源性和遗传进化分析结果显示，PCV3_USA2021 全基因组核苷酸序列与38 个参考毒株序列同源性为98.7%～99.8%，其中，PCV3_USA2021 与美国毒株（PCV3-US_SD2016）、巴西毒株（255_18_42）、中国重庆毒株（PCV3_CN_Chongqing-147_2016）、中国吉林毒株（PCV3-China_JL17-42）、中国山东毒株（PCV3_Shandong-03_2016）、中国广西毒株（PCV3/Guangxi-GL/04）等6 个毒株全基因组序列同源性最高，与俄罗斯毒株（PCV3-RU/SM17）和中国安徽毒株（PCV3/CN/Anhui-14/201611）同源性最低。

遗传进化关系分析结果（图2）显示，PCV3_USA2021 毒株与美国毒株（PCV3-US_SD2016）形成一个小的分支，与中国云南毒株（YN1-2017）、中国吉林毒株（PCV3-China_JL17-42）、中国山东毒株（PCV3_Shandong-03_2016）、中国重庆毒株（PCV3_CN_Chongqing-147_2016）、中国江西毒株（PCV3_CN_Jiangxi-62_2016）、中国广西毒株（PCV3/Guangxi-GL/04）、哥伦比亚毒株（PCV3_COL_Risaralda1_2018）、巴西毒株（255_18_42）、智利毒株（Type 3）、美国毒株（99）、日本毒株（KGS2098-1_2016 DNA）、韩国毒株（PCV3_KU-1605）等均处于一个大分支上，属于PCV3a亚群。

2.4 PCV3 毒株ORF1 基因核苷酸序列比对及推导氨基酸序列分析

将获得的美国毒株PCV3_USA2021 ORF1 基因序列（长度891 bp）与国内外38 个毒株进行核苷酸同源性和遗传进化分析。结果显示，PCV3_USA2021 与38 个参考毒株ORF1 基因核苷酸序列同源性为99.1%～99.9%。其中PCV3_USA2021 与美国毒株（PCV3-US_SD2016）、智利毒株（Type 3）、巴西毒株（255_18_42）、西班牙毒株（35）、中国吉林毒株（PCV3-China_JL17-42）、中国山东毒株（PCV3_Shandong-03_2016）、中国山西毒株（PCV3_Pig_CN_ShanXi170709）等7 条毒株ORF1 基因序列同源性最高，与俄罗斯毒株（PCV3-RU/SM17）及墨西哥毒株（PCV3/MEX/GTO/01/2017）同源性最低。

PCV3_USA2021 ORF1 基因序列推导的Rep 蛋白氨基酸序列（长度297 aa）与国内外38 个毒株同源性为95.3%～100%。其中，PCV3_USA2021 与美国毒株（PCV3-US_SD2016）、德国毒株（DE7.3）、智利毒株（Type 3）、巴西毒株（255_18_42）、越南毒株（NNH/DN7/2018）、西班牙毒株（35）、中国江西毒株（PCV3_CN_Jiangxi-62_2016）、中国重庆毒株（PCV3_CN_Chongqing-147_2016）、中国湖北毒株（CN/Hubei-618/2016）、中国山西毒 株（PCV3_Pig_CN_ShanXi170709）、中 国 吉林毒株（PCV3-China_JL17-42）、中国山东毒株（PCV3_Shandong-03_2016）、中国广西毒株（PCV3/Guangxi-GL/04）、中国福建毒株（FJ37）等14 条毒株推导的Rep 蛋白氨基酸序列同源性最高，与中国广东毒株（PCV3/CN/Guangdong-SG1/2016）同源性最低。

2.5 PCV3 毒株ORF2 基因核苷酸序列比对及推导氨基酸序列分析

将获得的美国毒株PCV3_USA2021 ORF2基因序列（长度645 bp）与国内外38 个毒株进行核苷酸同源性和遗传进化分析。结果显示，PCV3_USA2021 与国内外38 个毒株ORF2 基因核苷酸序列同源性为98.0%～100%。其中PCV3_USA2021 与美国毒株（PCV3-US_SD2016）ORF2基因同源性最高，与中国安徽毒株（PCV3/CN/Anhui-14/201611）同源性最低。

PCV3_USA2021 ORF2 基因序列推导的Cap蛋白氨基酸序列（长度214 aa）与国内外38 个毒株同源性为97.7%～100%。其中，PCV3_USA2021与美国毒株（PCV3-US_SD2016、99 和2164）、塞尔维亚毒株（NIVS）、西班牙毒株（35）、巴西毒株（255_18_42）、哥伦比亚毒株（PCV3_COL_Risaralda1_2018）、匈牙利毒株（PCV3/HU/Szerencs/2017）、韩国毒株（PCV3_KU-1605）、墨西哥毒株（PCV3/MEX/GTO/01/2017）、意大利毒株（PCV3-IT_CO2017）、日本毒株（KGS2098-1_2016 DNA）、智利毒株（Type 3）、中国山西毒株（PCV3_Pig_CN_ShanXi170709）、中国广东毒株（PCV3/CN/Guangdong-SG1/2016）、中国福建毒株（FJ37）、中国南京毒株（PCV3 CN Nanjing 2017）、中国重庆毒株（PCV3_CN_Chongqing-147_2016）、中国江西毒株（PCV3_CN_Jiangxi-62_2016）、中国广西毒株（PCV3/Guangxi-GL/04）、中国吉林毒株（PCV3-China_JL17-42）等21 条毒株推导的氨基酸序列同源性最高，与俄罗斯毒株（PCV3-RU/SM17）同源性最低。

采用生物信息学软件对所得的美国毒株PCV3_USA2021 与国内外38 个毒株Cap 蛋白进行氨基酸位点突变分析。结果（表3）显示，39 条氨基酸序列之间存在16 个突变位点，分别位于5、7、24、27、56、75、77、88、104、124、132、139、150、156、169、211 aa 位置，而本次扩增毒株PCV3_USA2021 以上位点没有突变。

表3 PCV3 Cap 蛋白氨基酸突变位点比对分析

3 讨论

本研究通过采集死亡的进口美国种猪组织，设计引物扩增、拼接后，获取1 条全基因组长度约为2 000 bp 的PCV3 全基因序列，将对应毒株命名为PCV3_USA2021。然后将其与GenBank 收录的38 个国内外不同地区PCV3 参考毒株进行全基因组序列、ORF1 和ORF2 序列比对。分析结果显示，该毒株全基因组序列与参考毒株全基因组具有较高的同源性（98.7%～99.8%），表明不同地区PCV3 的分布没有明显的地域性，PCV3 基因遗传进化特性相对稳定。同时，获得的PCV3 毒株全基因组序列与国内外38 条PCV3 毒株之间的ORF1 及ORF2 的同源性（分别为99.1%～99.9%和98.0%～100%）均高于全基因组序列之间的同源性，且ORF2 基因推导的Cap 蛋白氨基酸之间同源性为97.7%～100%，其中与21 条毒株Cap 蛋白氨基酸序列完全一致。分析结果表明，PCV3 进化相对比较保守。其中，毒株PCV3_USA2021 与美国毒株（PCV3-US_SD2016）同源性最高（99.8%），且通过构建进化树分析发现，该毒株与美国毒株（PCV3-US_SD2016）亲缘关系最近。

根据全基因组序列比对获得的进化树分析结果，推定毒株PCV3_USA2021 为PCV3a 亚型。2016—2018 年美国中西部地区PCV3 流行情况研究报道[14]显示，PCV3a 和PCV3b 两种亚型在美国中西部广泛流行。本研究获取的毒株来自美国中西部地区（内布拉斯加州）进口种猪，与该报道的PCV3a 亚型在美国中西部流行情况一致。

PCV3 Cap 蛋白为主要结构蛋白，可诱导动物机体产生特异性免疫应答。Cap 蛋白氨基酸位点24 位于PCV3 抗体识别表位[19]。Cap 蛋白序列氨基酸位点比对结果显示，PCV3a 和PCV3b ORF2基因编码蛋白的氨基酸位点分别为缬氨酸（V）和丙氨酸（A），说明不同亚种PCV3 毒株可能在抗原性方面存在差异，需进一步研究。因此在种猪引种时，除做好病原检测外，还应结合产地疫病流行情况，选择针对流行毒株的疫苗，提高疫苗免疫保护率，减少经济损失。