HPLC 测定枳实薤白桂枝汤颗粒中辛弗林的含量

罗 平 范茜茜

（1.武汉市江夏区第一人民医院药剂科，湖北 武汉 430200；2.江汉大学附属医院武汉市第六医院中药剂科，湖北 武汉 430015）

《金匮要略》中有记载：“胸痹心中痞，留气结在胸，胸满，胁下逆抢心，枳实薤白桂枝汤主之”[1]。方剂由枳实、薤白、瓜蒌、厚朴、桂枝五味药材组成，具有通阳散结、祛痰下气之功效。现代药理学证实本方具有改善心肌缺血、修复心肌缺血再灌注损伤、调节血脂等作用[2-4]。方中枳实含有辛弗林、乙酰去甲辛弗林、柚皮苷、橙皮苷、N-甲基酪胺和γ 氨基丁酸等多种活性成分，能增强胃肠道及心血管平滑肌的收缩力[5]。鉴于颗粒剂较汤剂有服用方便、稳定、口感好等优点，且根据本方出膏率的情况，颗粒剂可最大程度保留药物成分，因此选择制成颗粒剂[6]。查阅文献，目前对于枳实薤白桂枝汤颗粒剂的质量标准研究较少，多数对其质量控制方面主要是对处方中有效成分厚朴酚、和厚朴酚、柚皮苷等建立含量测定项目[7，8]，未见对辛弗林的含量测定的报道。笔者通过建立方法学考察，对本方颗粒剂辛弗林含量测定分析方法进行评估，为进一步完善质量标准提供借鉴。

1 仪器与试药

1.1 仪器DIONEX P680 高效液相色谱仪、VWD 检测器及Chromeleon 色谱工作站。Agela Technologies Promosil C18色谱柱（5 μm，100 A，4.6×250 mm），赛多利斯BP211D 电子分析天平（德国赛多利斯股份公司），SK2200H 型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司），SZ-93 型自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂），电热恒温鼓风干燥箱（黄石市恒丰医疗器械有限公司），HH-2 型数显恒温水浴锅（国华电器有限公司），HC·TP11B·10 架盘药物天平（北京医用天平厂），DZF-6050 真空干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）。

1.2 试剂与试药辛弗林标准品（110727-200306，供含量测定用，中国药品检定所）；甲醇（Tedia As1122-001色谱醇），磷酸二氢钾（上海实验试剂有限公司批号20180323）；十二烷基磺酸钠（上海英鹏化学试剂有限公司）；甲醇、冰醋酸均为分析纯，蒸馏水为双蒸水。枳实薤白桂枝颗粒（自制，批号20190507、20190516、20190530），枳实薤白桂枝颗粒阴性对照系按相同工艺制备的缺少相应药味的颗粒剂。

2 方法与结果

2.1 色谱条件以甲醇-磷酸二氢钾溶液（0.6g磷酸二氢钾，1.0g十二烷基磺酸钠，1mL冰醋酸加水定容至1000mL）50∶50为流动相；检测波长275nm；流速0.84mL·min-1；柱温34℃；进样量10 μL；Agela Technologies Promosil C18色谱柱（5 μm，100 A，4.6×250 mm）。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备精密称取辛弗林对照品1.54 mg，加70%甲醇定容至10 mL，摇匀，备用。既得（154 μg·mL-1）对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备取本品颗粒约10 g，研细，取5 g 细粉，精密称定，置100 mL 锥形瓶中，精密量取50 mL 50%甲醇溶液，盖紧瓶塞，称定重量，超声提取30 min 后，静置放冷，擦干外壁，称定重量，加溶剂补足减失重量，抽滤，精密吸取10 mL 续滤液于蒸发皿中，恒温水浴锅60 ℃下挥干甲醇，再加10 mL 蒸馏水溶解，上聚酰胺柱（60～90 目，2.5 g，内径1.5 cm，干法装柱），继续用蒸馏水洗脱，收集洗脱液定容至25 mL，过0.45 μm微孔滤膜，既得。作为测定辛弗林含量的供试品溶液。

2.2.3 阴性对照溶液的制备取阴性对照制剂，并按“2.2.2”项下方法制备阴性对照溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 阴性干扰试验分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液适量，按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱，见图1。结果可见，辛弗林色谱峰位置未见其他干扰峰出现。

图1 高效液相色谱图

2.3.2 线性关系考察精密吸取上述已知浓度的对照 品溶液（154 μg·mL-1）0.5、0.75、1.5、5mL置于10mL的容量瓶中，用溶剂定容至刻度线，加上母液共制成5 个浓度对照品溶液，进样量均为10 μL。以样品浓度（μ g·mL-1）为横坐标，峰面积值为纵坐标绘制标准曲线，计算得线性方程为y=0.0953x-0.1098，r=0.9997。实验结果表明，辛弗林在7.7～154.0 μg·mL-1浓度范围内线性关系良好。

2.3.3 精密度试验取对照品溶液（23.10 μg·mL-1），进样量均为10 μL，连续进样6 次，分别记录峰面积，RSD 为1.21%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性考察取本品同一供试品溶液分别于0、2、4、8、12、24 h 后进样，测定峰面积。进样量均为10 μL，测定峰面积，RSD 为1.25%（n＝6），表明供试品在24 h 内稳定。

2.3.5 重现性试验取本品（批号20190530）6 份，按2.2.2项下方法制样，进样量均为10 μL 测定其辛弗林含量。结果，平均含量为0.3872 mg·g-1，RSD=0.99%，小于2%（n=6），表明本品含量测定方法重现性较好。

2.3.6 加样回收试验精密称取已知含量的样品（批号20190530，辛弗林含量为0.3872 mg·g-1）9 份，每份2.5 g，每份样品中按低、中、高3 种不同浓度精密加入辛弗林对照品（0.4791 mg·mL-1）1、2、3 mL，编号，按方法“2.2.2”制备供试品溶液，计算样品含量及加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果

2.3.7 耐用性试验为考察该方法的耐用性，我们分别控制样流动相配比、检测波长、温度、流速以及乙酸含量等因素在小范围内波动，以同一品进行含量测定，以每次实验测得的辛弗林含量的RSD值为指标进行考察，结果及其分析表见表2、表3。由试验结果可知，流速、柱温、pH值、检测波长、流动相配比范围上调和下调时的变化对本品含量测定的影响结果RSD值均小于2%，符合要求，该方法耐用性良好。

表2 辛弗林耐用性考察结果

表3 辛弗林耐用性考察结果分析

2.4 样品含量测定按“2.2.2”项下方法处理样品，并按“2.1”项下色谱条件测定3 批次样品中辛弗林的含量（每批次3 次）。结果3 批样品中辛弗林平均含量分别为0.39、0.38、0.39 mg·g-1。若允许其含量为最低含量下浮的幅度不超过20%，则含量限度暂定为：本品含辛弗林不得低于0.31 mg·g-1。

3 结果

在上述色谱条件下，辛弗林在7.7～154.0 μg·mL-1浓度范围内线性关系良好r=0.9997；仪器精密度良好RSD＜2%；重现性RSD=0.99%；稳定性RSD＜2%；平均回收率为95.21%，RSD 为2.26%；当流动相配比、检测波长、温度、流速以及乙酸含量等因素在小范围内波动时，以同一样品进行含量测定，每次实验测得的辛弗林含量的RSD＜2%，表明此方法耐用性良好。

4 讨论

4.1 供试品溶液的制备结合文献，对辛弗林含量的测定普遍参考《中华人民共和国药典》2015 年版一部中枳实[含量测定]项下的制备方法进行供试品溶液的制备[9-11]，结果表明此方法结果准确、重复性好，方法可行。但对样品的处理步骤相对较复杂，后续可以针对简化样品处理方法进行研究[12]，提高效率。

结合文献参考选择用甲醇、50%甲醇、水作为辛弗林提取溶剂[13]，以峰的分离情况和样品中辛弗林转移率为考察指标做平行对照试验，选择提取溶剂。结果显示辛弗林转移率分别为甲醇39.88%、甲醇（50%）63.42%、水52.9%。因此选择50%甲醇为提取溶剂。

4.2 研究价值笔者采用HPLC 法测定颗粒剂中辛弗林含量，并进行方法学考察，结果表明此法结果准确，重现性及耐用性良好。可为该制剂质量控制提供一定借鉴，同时也可为其他中成药制剂中枳实的质量控制提供参考。