调控网络分析肺栓塞患者外周血中lncRNAs、miRNAs和mRNAs的差异表达①

何丽丽，曹国磊，马荣辉，唐 乐，佟玉珊，李 宏，罗 琴

（新疆医科大学附属肿瘤医院呼吸神经内科，乌鲁木齐 830011）

肺栓塞综合征是指体循环的各种栓子脱落阻塞肺动脉及其分支引起肺循环障碍的临床病理生理综合征，最常见的肺栓子为血栓，由血栓引起的肺栓塞也称肺血栓栓塞症（Pulmonary thromboembolism，PTE）[1]。与缺血性心脏病相比，PTE是第三大常见的心血管死亡原因[2]。非编码RNA是指序列上缺乏明显的开放读码框，不具有编码蛋白能力的一类RNA，包括长链非编码RNA(lncRNAs)、环状RNA(CircRNAs)和微小RNA(MiRNAs)，其不能编码蛋白，这一类RNA能够在低氧环境下受低氧诱导因子（HIF）调控，参与慢性血栓栓塞性肺动脉高压的形成[3]。lncRNAs与miRNAs均在缺氧调节中有重要作用，近年来有研究发现lncRNAs[4]和miRNAs[5]在PTE患者血清中呈现高表达状态，其作用机制尚不清楚。本研究采用高通量测序的方法探究肺栓塞患者及健康人血液中的差异表达基因（DEGs），进行lncRNAs、miRNAs和mRNAs的调控网络分析，筛选可能的作用分子，为PTE的后续研究及诊疗策略奠定基础，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料以2019年1月-12月新疆医科大学附属肿瘤医院呼吸神经内科收治的4例肺栓塞患者为PTE组，男女各2例，年龄53～58岁，平均年龄（55.00±2.16）岁，选择同期4例健康体检者为对照组，男女各2例，年龄50～58岁，平均年龄（52.50±3.78）岁，两组患者基本资料具有可比性（P＞0.05）。本研究通过新疆医科大学附属肿瘤医院伦理委员会审批（批准号：2019BC007），受试者均知情同意且签署知情同意书。

1.2 纳入与排除标准[1]

1.2.1 纳入标准PTE组纳入标准，经肺动脉造影明确肺动脉存在血栓；对照组选取标准，选取与PTE组性别比例、年龄相当，相同地区健康人群作为对照组。

1.2.2 排除标准PTE组排除标准:有心脑血管疾病史、内分泌疾病史、免疫疾病史、恶性肿瘤病史，既往有血栓栓塞性疾病病史；对照组排除标准:既往有心脑血管、血液、内分泌、肝肾疾病、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、哮喘等病史的人群。

1.3 方法

1.3.1 样本制备及总RNA提取采用BD 762165 Blood RNA Tube全血RNA采血管采集受试者外周静脉血，取2.5 mL至RNA保存管，30次/min涡旋30 s，置于-80℃冰箱稳定保存。按TRIzol® Reagent试剂盒说明操作测定血浆中的总RNA。的总RNA。

1.3.2 illumina转录组测序选择8个RNA样本采用HiSeq2500(美国Illumina平台)测序，分别对lncRNAs（链特异性建库）、miRNAs（小RNA文库）进行建库，通过片段去除、链合成、端部修理和A-尾部及适配器连接、PCR扩增、群集生成、质量控制后，进行综合测序。

1.3.3 筛选DEGs采用R语言对DEG软件包数据进行分析并进行t检验。用DEG软件包对差异表达的lncRNAs、miRNAs、mRNAs进行分析，将P值设置为0.05，同时进行差异表达的miRNAs、mRNAs相关性分析。

1.3.4 DEGs的代谢/信号通路（KEGG）和基因本体（GO）富集分析对基于调控网络中的差异表达基因，进行富集分析。使用KOBAS软件对差异表达的miRNA同时进行疾病、KEGG和GO的分析，其中GO包含了生物进程（BP）、细胞成分和分子功能（MF）3部分。

1.3.5 靶基因预测以mRNA的3‘UTR区域作为靶基因预测数据库，使用靶基因预测软件miRanda（3.3a）对差异miRNAs进行靶基因预测，以明确靶基因对的数量。预测软件miRanda的阈值设置为：Score≥140且Energy≤-20 kcal/mol。在共表达分析得到的lncRNA-mRNA关系对的基础上，通过软件lncT ar预测其是否存在靶向调控，对结果中的lncRNA-mRNA对进行调控网络可视化绘制。

1.3.6 ceRNA（lncRNA-miRNA-mRNA）预测通过targetscan软件预测ceRNA，在仅有lncRNA和mRNA表达数据的情况下，基于软件预测的miRNA结合数据，进行ceRNA预测分析，预测与lncRNAmRNA共同匹配共享的microRNA。

2 结果

2.1 两组一般资料比较与对照组比较，PTE组年龄、性别恶性肿瘤病史、血栓病史、免疫系统疾病病史、制动、创伤及PTESI分级差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 PTE组与健康对照组一般资料比较

2.2 测序结果

2.2.1 illumina转录组测序的结果PTE组与健康对照组静脉血之间存在大量DEGs,共有1 109个上调基因和1 288个下调基因，其中包括TLR3、TLR4等已知的与PTE相关的基因。

2.2.2 差异表达的lncRNAs、miRNAs、mRNAs的分布情况通过基因测序检测差异表达的lncRNAs中有195个 上 调：包 括AL359715.1、MIAT、LINC02432、AC099524.1、LINC01754、TPRG1-AS1、AC012306.2、AL645933.2、LINC02432、NBR2、MALAT1等；235个lncRNAs下 调:包 括LINC00667、AC245014.1、AL513314.2、LINC00963、PRKCQ-AS1、LINC01801、LINC01237、AC092683.1、AL158210.1等,见图1A。差异表达的mRNAs中有731个上调，790个下调,见图1B；下 调mRNA top10包 括：CUL9、VAMP7、PITPNM2、KRBOX4、MZT2B、TCEA3、MED23、SLC35C2、C19orf25、FAM107B；上 调top 10包 括：WDYHV1、LTBP4、MIA、NFATC1、ENOPH1、TP53I11、MS4A4A、AL109811.4、SLC9A9、INTS2；差异表达的miRNA分为已知的和新发现的，新发现的miRNA中有25个上调，8个下调,见图1C，已知的miRNA中有16个上调，14个下调,见图1D。

图1 差异表达的DEGs分布火山图

2.2.3 DEGs的GO及KEGG分析对于KEGG途径富集分析，以P＜0.05为筛选条件，结果显示DEGs主要参与的通路有基因表达、Wnt信号通路、细胞周期蛋白激酶1(PLK1)在G2/M期的活性调节、TLR级联中MAP激酶的活化、细胞周期、DNA重建等，见图2。

图2 差异基因在代谢/信号通路中的富集分析

2.2.4 靶基因预测计算差异表达miRNAs(known miRNAs 和 novel miRNAs)和差异表达基因两两间的表达相关系数，筛选显著负相关的关系对。miRanda软件预测miRNA-靶基因，与上一步的结果取交集，并构建miRNA-基因表达调控网络。miRNA-lncRNA调控关系68对，其中靶基因数目最多的为miR-1260a及miR-1260b，见图3A、B。

图3 A miR-1260a靶基因调控网络图

图3 B miR-1260b靶基因调控网络图

2.2.5 ceRNA（lncRNA-miRNA-mRNA）预测通过 ceRNA预测分析表明，在差异表达基因中预测与ln-cRNA-mRNA共同匹配共享的microRNA，共有11对调控关系，其中调控关系最多的为miR-1260b和miR-1260a，见表2。

表2 lncRNA-mRNA预测ceRNA表

3 讨论

PTE具有高发病率与高致死率，了解及掌握PTE发病机制及其基因调控机制对于PTE的诊断及治疗具有重要指导意义。本研究通过对PTE患者及健康人血液中DEGs的分析显示，PTE及健康人血液中存在大量基因差异性表达，包括,lncRNAs、miRNAs及mRNAs，这与Starikova I[6]等学者的研究一致。

因循环中的miRNAs稳定存在于血浆、血清和其他体液中，因此大部分研究将其应用于血栓栓塞性疾病的诊断中。现有报道显示，血栓栓塞性疾病具有诊断意义的miRNA有miR-134、miR-28-3P、miR-1233、miR-27a、miR-134等[7]。其中一项大鼠深静脉栓塞模型研究[8]显示，在低氧状态下，miR-13b-3p、miR-15a-5p、miR-92a-3p、miR-195-5p、miR-497-5p能靶向调控mRNA引起内皮功能障碍，导致血栓形成。本研究差异表达的miRNA中并未找到上述几类miRNA,考虑与血液标本物种差异、鉴定DEGs方法不同相关。但相同的是，经过miRNA-mRNA调控分析显示，在PTE患者血液中，存在miRNA-mRNA调控机制，且存在miRNA-lncRNA调控机制。本研究中共预测出miRNA-mRNA调控关系140对，其中靶基因调控关系最多的为miR-1260b及miR-1260a。

目前miR-1260a及miR-1260b的研究甚少，且集中于恶性肿瘤，包括前列腺癌[9]、非小细胞肺癌[10]、宫颈癌[11]等恶性肿瘤中，暂无miR-1260b及miR-1260a关于PTE的研究。本研究显示，miR-1260b及miR-1260a共同 调 控 的 靶 基 因有HAUS5、NFIC、ARHGEF12，经过KEGG分析显示，其参与的通路有：癌症途径、癌症中的蛋白多糖、血管平滑肌收缩、血小板活化等。由此可见miR-1260b及miR-1260a可能作用于靶基因通过以上甚至更多通路引导PTE形成。

有研究发现在深静脉血栓患者内皮祖细胞中发现一系列与DVT相关的新的lncRNAs，由此揭示lncRNA可能在血栓栓塞性疾病中发挥重要作用[5]。本研究亦在PTE患者及健康人外周血中发现大量差异表达lncRNA，这些基因的功能尚待进一步开发及探索。lncRNAs和miRNAs在许多过程中发挥着相似的关键作用，包括细胞增殖、凋亡和癌症发生[12-13]。本研究首次于PTE中发现lncRNA-miRNA-mRNA调控网络，且在所有调控关系中，miR-1260a、miR-1260b关系最为密切，这两种miRNA有可能成为PTE诊疗的潜在靶点，实验组后组拟开展进一步研究。

综上所述，本研究通过对PTE患者及健康对照组的外周血进行基因测序发现大量差异表达的DEGs，在PTE中建立了一个基因调控网络，这些DEGs可能通过基因表达、Wnt信号通路、TLR级联中MAP激酶的活化等信号通路可能参与了PTE的发 生。miR-1260b和miR-1260a可能作为ceRNA在PTE的发生、发展中起到重要作用，有望成为PTE的潜在诊治靶点。