肺腺癌患者血清中非编码RNA差异表达的分析研究①

牛海文,崔浩波,李 宏，曹国磊,何丽丽,曹嘉芮,张 迪，罗 琴

（新疆医科大学附属肿瘤医院呼吸神经内科，乌鲁木齐 830011）

肺癌是世界范围内造成死亡最多的恶性肿瘤之一，2020年仅美国新确诊的肺癌患者为228 820例，其中85%为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）[1]。肺腺癌是NSCLC最常见的亚型,患者总体存活率较低[2-3]，寻找有效诊断肺腺癌的生物标志物尤为重要。长链非编码RNA(LncRNA)是一种长度超过200 nt的ncRNAs[4]，LncRNA在许多生物学过程中发挥关键作用，已成为肿瘤诊断和治疗的关键生物标志物[5]。有研究表明,lncRNA MUC5B-AS1在肺腺癌组织中上调，通过与MUC5B形成RNA-RNA双链体来促进细胞迁移和侵袭[6]；lncRNA MYOSLID通过调控miR-339-5p促进肺癌细胞的增殖、迁移及侵袭,抑制细胞凋亡[7]；肺癌患者血浆lncRNA H19水平显著高于肺良性病变患者及健康对照人群,与临床病理学特征相关,在肺癌诊断中具有一定价值,可辅助传统肿瘤标志物用于肺癌诊断及病情评估[8]。本研究采用RNA测序技术对比分析肺腺癌患者和健康人群外周血中lncRNA表达差异,并对其靶向的mRNA行GO及KEGG分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2019年1月-2019年12月就诊于新疆医科大学附属肿瘤医院呼吸科的4例肺腺癌患者为实验组，其中男2例，女2例，平均年龄（55.16±2.25）岁，选择同时期4例健康体检者为对照组，其中男2例，女2例，平均年龄（54.32±3.12）岁。本研究通过新疆医科大学附属肿瘤医院伦理委员会审批（批准号：2019BC007），受试者均知情同意且签署知情同意书。

1.2 纳入及排除标准

1.2.1 纳入标准（1）就诊者具备完整准确的的个人信息及临床资料；（2）NSCLC组经病理确诊且期别为III-IV期的患者；（3）健康对照组无任何基础疾病；（4）符合知情同意原则。

1.2.2 排除标准（1）合并任何基础疾病的患者；（2）确诊NSCLC但已经过化疗、放疗或靶向治疗；（3）除NSCLC以外还合并有其他恶性肿瘤的患者。

1.3 方法

1.3.1 样品的采集选用含RNA保护剂的保存管,分别采集肺腺癌和健康对照组外周静脉血液到采血管，与血液RNA保存管连通，管中负压将自动转移2.5 mL血液至RNA保存管，上下颠倒混匀保存管15～30次，以保证血液与保存液充分混合。

1.3.2 患者外周血中总RNA的提取方法取“1.3.1”项下样本2.5 mL加入5 mL离心管中，使用TRIZOL试剂盒(美国Invitgen公司)从肺腺癌及健康体检者外周血中提取总RNA。随后进行甲醛变性胶电泳，选择质量合格的Total RNA作为RNA测序的建库起始样品，采用QUBIT RNA ASSAY KIT对起始的Total RNA进行准确定量。

1.3.3 RNA文库建立及测序QUBITRNABR测定试剂盒对起始的总RNA进行准确定量,采用Ribo-Zero™Magnetic Kit(Epicentre)对总RNA中rRNA进行分离去除，RNA 6000Pico芯片对去除rRNA的总RNA进行质控，构建好去除rRNA的质控转录测序文库后，用QUBIT DNA HS ASSAY KIT对PCR产物进行准确定量然后进行RNA测序。

1.4 指标的测定

1.4.1 肺腺癌对比健康正常人差异表达的lncRNA测定用Fastp软件对原始数据过滤及分析。利用limma包进有生物学重复或配对的差异比较，利用DESeq包进行没有生物学重复的差异比较。差异基因筛选标准为：|log2FC|≥1且P≤0.05，利用R语言对筛选出的差异表达基因做层次聚类分析，构建差异lncRNA图谱。利用火山图展示差异表达的lncRNA，利用热图对差异分析中的两组样品可以有效的区分开，互为重复的样品会更好的聚到一起。

1.4.2 对差异表达的lncRNA行GO及KEGG分析对上述筛选得到的差异lncRNA,对其进行靶向的mRNA导入Metascape网站(http://metascape.org/gp/index.html)中进行GO功能及KEGG通路富集分析（分析参数：MinOverlap≥3，MinEnrichment≥1.5，P＜0.05），通过Fisher Exact Test计算P值，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺腺癌患者外周血中lncRNA的表达差异谱与健康正常人对照组相比，在肺腺癌外周血中共筛选出804个差异lncRNA表达（P＜0.05），其中425个lncRNA上调，379个lncRNA下调。本研究按照差异倍数大小（差异倍数值）分别列出了排序前10的上调和下调lncRNA，见图1A、B和表1。图1A聚类分析图：图中横坐标代表不同的样本名称，纵坐标代表差异的转录本，对肺腺癌组和对照组8个样本进行等级聚类分析，图中的每个矩型代表一个基因表达值，红色表示表达上调的基因，绿色表示表达下调的基因。差异表达的lncRNA由火山图1B显示，横坐标为表达量差异倍数的log2值,纵坐标为差异表达分析中P值取负对数后的值,绿色切片和红色切片显示肺腺癌组织中异常的lncRNA表达分别下调和上调2倍以上(P＜0.05)，黑色的点代表无显著差异的lncRNA。

图1 肺腺癌组与正常对照组差异lncRNA表达的聚类分析与火山图

表1 肺腺癌和正常对照组中差异倍数排名前10的上、下调lncRNA

2.2对于差异lncRNA靶向的mRNA行GO及KEGG分析与健康对照组相比，肺腺癌组主要涉及生物学途径有核转录的mRNA分解过程、SRP依赖性共翻译蛋白靶向膜、翻译起始等过程；细胞成分中与细胞内细胞器部分、非膜细胞器等有关；分子功能涉及到聚（A）RNA结合、氧化还原酶活性，作用于NADH等，见表2。与健康对照组相比，肺腺癌组涉及的KEGG通路结果显示在肺腺癌对比正常组织中，排名前10的KEGG通路主要涉及到核糖体、氧化磷酸化、HIF-1信号通路、B细胞受体信号通路等，见表3。

表2 排名前5的GO分类富集表

表3 排名前10的KEGG Pathway分析表

3 讨论

近年来，研究基因在疾病中的发生发展作用越来越受到各界人士的青睐，在肺腺癌发生过程中往往伴随着许多相关基因的异常表达和基因改变。有研究表明，LINC02193在蛛网膜下腔出血患者外周血中表达上调，提示它们可能作为蛛网膜下腔出血的生物标志物或抑制蛛网膜下腔出血所致神经损伤的治疗靶点[9]，本研究发现，LINC02193在肺腺癌患者外周血中高表达，但未见相关报道，因此LINC02193是否也可以作为肺腺癌患者治疗靶点需要进一步考证。Wu等人证实[10]MIAT在NSCLC中显著上调，特别是在侵袭性病例中，并且与不良预后密切相关。其通过吸附miR-184，进而上调剪接因子1(SF1)的表达部分发挥了致癌作用，为MIAT在NSCLC进展中的潜在治疗应用提供了新的视角。这与本研究结果相一致。SNHG17基因，名为小核仁RNA宿主基因17。近年来，SNHG17被认为是结肠癌中一种新的致癌基因[11]，有研究表明SNHG 17通过靶向miR-485-5p来上调WLS的表达，从而抑制肺腺癌细胞增殖、迁移和侵袭，但促进细胞凋亡[12]。然而姜翠红等人报道SNHG17在肺癌中高表达,促进肺癌细胞增殖,并通过调节p57的表达来抑制肺癌细胞的增殖和迁移[13]，提示SNHG17在肺癌中的具体作用机制仍有待进一步研究。

唐玲玲等[14]研究发现，与良性肺病患者相比NSCLC患者血浆TUG1表达下调,TUG1与UCA1联合诊断NSCLC优于TUG1、UCAI、CEA、CYFRA21-1四指标单独诊断,有望成为诊断NSCLC的潜在生物标志物，与本研究结果一致。lncRNA-TUG 1过表达可抑制顺铂(DDP)耐药NSCLC细胞的增殖、迁移、侵袭，促进细胞凋亡和自噬，其水平的调节为提高非小细胞肺癌化疗药物的抗肿瘤疗效提供了新的途径[15]。因此TUG1在肺腺癌中低表达很值得研究。LINC 01503是一种超增强子驱动的长时间非编码RNA，在多种类型的人类癌症中被调控。它在NSCLC癌组织中表达量升高,miR-335-5p表达量下降,二者表达量呈负相关,可能成为提示NSCLC预后新的肿瘤标志物[16]。对 于 差 异lncRNA靶 向 的mRNA行GO及KEGG分析，GO分析表明，翻译起始为主要作用。高通量分析已经鉴定出数以千计的哺乳动物转录本具有翻译起始，除了IRES介导外，还涉及交替的5‘帽识别、mRNA序列元件和核糖体选择。这些机制确保了在帽依赖翻译被关闭的情况下特定mRNA的翻译，并促进包括心脏肥厚和癌症在内的病理状态[17]。

综 上 所 述，LINC02193、SNHG17、TUG1、LINC01503可作为肺腺癌发生发展的标志物，肺腺癌的发生与核糖体、代谢途径等通路有关,为肺腺癌的诊治提供了新的思路。本研究样本数量较少，存在一定的局限性，因袭后期课题组拟扩大样本量深入研究，并对筛选所得差异显著lncRNA及其目的基因等进行进一步验证研究。

[收稿日期:2021-09-01]