蔓三七提取物对酵母膏和氧嗪酸钾致小鼠急性高尿酸血症治疗效果的研究

胡居吾

（江西省科学院应用化学研究所，江西南昌 330096）

高尿酸血症（Hyperuricemia，HUA）是指在正常嘌呤饮食状况下，血液中尿酸（Uric Acid，UA）含量异常升高的异质性疾病。流行病学研究发现，HUA与痛风、高血压、高血脂、动脉硬化、冠心病、糖尿病以及肥胖症等疾病密切相关。

蔓 三 七 [Gynura procumbens（Lour.） Merr.]，分布于我国广东、海南、贵州、云南等地，越南、泰国、印度尼西亚和非洲也有分布，具有清热解毒、止血止咳、活血通络、提高人体免疫力和抗病毒能力、抗感冒、降“三高”、提高免疫力等功效[1]，是一种无毒级的药食兼可的植物。有研究表明，蔓三七具有抗高尿酸作用[2]，但没有文献报道蔓三七对急性高尿酸血症是否具有治疗效果。

在前期研究中，考察了蔓三七叶粗提取物（MSQ1）对氧嗪酸钾致小鼠急性高尿酸血症治疗效果[3]。结果表明，不同剂量组的MSQ1对由氧嗪酸钾引起的高尿酸值无显著性影响，其原因可能是蔓三七叶粗提取物纯度不高、杂质较多，功效成分含量不高，起不到效果。

因此，本文在蔓三七叶粗提取物（MSQ1）的基础上，对其进行纯化，得到蔓三七叶提取物（MSQ2），然后考察其在高尿酸血症治疗方面的效果。同时，选择腹腔注射酵母膏和氧嗪酸钾，建立一个稳定可靠的小鼠急性高尿酸血症模型，采用测定血清中尿酸值的变化评价蔓三七叶提取物（MSQ2）对急性高尿酸血症的影响。

1 材料与方法

1.1 实验对象

蔓三七叶，由江西华紫仁农业开发有限公司提供。

8周龄健康雄性昆明小鼠（20～22 g），SPF级，购于北京斯贝福生物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2019-0010。动物房温度21～24 ℃，相对湿度55%～62%。任何疑似非健康小鼠在试验前均已剔除。

1.2 药品与试剂

羧甲基纤维素钠（CMC-Na），美国Sigma-Aldrich公司；酵母膏，美国赛默飞世尔科技公司；氧嗪酸钾（PO），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；绿原酸标准品和异绿原酸A、B、C标准品，成都曼斯特生物科技有限公司；氯化钠，国药集团化学试剂有限公司；UA试剂盒，北京索莱宝科技有限公司。

1.3 主要仪器

3001型酶标仪，上海赛默飞世尔公司；Sykam S-501型制备液相色谱，德国Sykam 公司，包括四元泵（S1130）、自动进样器（S5300）、柱温箱（S4115）、UV/Vis检测器（S3250）以及用于数据收集和处理 的Clarity工 作 站；Shim-pack GIST C18column（4.6 mm×250 mm, 5μm）色谱柱，日本岛津公司。

1.4 实验方法

1.4.1 蔓三七粗提取物的提取

蔓三七干叶10 kg，加入水200 kg，用柠檬酸调节提取液pH值至3.0，提取1.5 h后过滤，再加入水200 kg，用柠檬酸调节提取液pH值至3.0，提取1.0 h，合并提取液，浓缩，喷雾干燥（进风温度120 ℃，出风温度82 ℃），得蔓三七粗提取物（MSQ1）。

1.4.2 蔓三七粗提取物的纯化

将蔓三七粗提取物（MSQ1）用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，真空浓缩回收乙酸乙酯，再进行真空冷冻干燥，得到蔓三七提取物（MSQ2）。

1.4.3 绿原酸及异绿原酸含量的测定

色谱条件：HPLC溶剂分别为H2O和0.1%乙酸（V/V）作为水溶剂（A）和甲醇作为有机溶剂（B）。

梯度洗脱方式：0～15 min，30%B；15～25 min，30% → 50%B；25～ 40 min，50%B；40～ 41 min，50%→30%B，41～50 min，30%B。柱温为35 ℃，流速为1.0 mL/min，检测器波长为327 nm，进样量为10 μL。

1.4.4 药物配制

0.5%CMC-Na过滤后用于配制蔓三七提取物（MSQ2）低剂量（150 mg/mL）、中剂量（300 mg/mL）和高剂量（600 mg/mL）3个剂量组；用生理盐水配制氧嗪酸钾（30 mg/mL）；用灭菌水配制酵母膏（30 g/kg）。

1.4.5 动物分组和建模

小鼠在恒温（23±2）℃，相对湿度50%～60%，光照、黑夜各12 h，适应性喂养3 d后，随机分为5组，即正常对照组，模型组，蔓三七提取物（MSQ2）低剂量组（150 mg/kg）、中剂量组（300 mg/kg）和高剂量组（600 mg/kg），每组7只，给药体积均为0.1 mL/kg。模型组和药物组每天早、晚9点灌胃酵母膏，灌胃体积为0.1 mL/kg；每天上午9点灌胃酵母膏后立即腹腔注射PO，剂量为300 mg/kg，1 h后药物组分别灌胃不同剂量蔓三七提取物，连续给药7 d，正常对照组和模型组分别灌胃等体积的0.5%CMC-Na。

1.4.6 血清中尿酸的测定

小鼠麻醉后利用1 mL注射器心脏取血，将取出的血样沿着1.5 mL EP管壁轻轻打出，室温下静置1 h后，在4 ℃下以3 000 r/min离心10 min，取上清液按照UA试剂盒说明书测定吸光值并代入标准曲线计算血清尿酸的含量。

1.5 统计学处理

采用GraphPad Prism8.0进行数据统计分析，计量资料以“均数±标准差”（±s）表示，采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 蔓三七提取物（MSQ2）中绿原酸及异绿原酸的含量

绿原酸及异绿原酸A、B、C标准曲线如图1所示，绿原酸的标准曲线为y=26.325x-163.49，相关系数R2=0.9989；异绿原酸A、B、C标准曲线分别为y=42.893x-398.69、y=24.119x-330.74、y=40.604x-381.62，相关系数R2分别为0.9980、0.9934、0.9983。通过峰面积，可以计算得到绿原酸及异绿原酸A、B、C的含量，见表1。

图1 绿原酸及异绿原酸A、B、C标准曲线

表1 蔓三七粗提取物（MSQ2）中绿原酸及异绿原酸含量

2.2 尿酸标准曲线

将5 μmol/mL的标准液用蒸馏水稀释为0.5 μmol/mL、0.25 μmol/mL、0.125 μmol/mL、0.0625 μmol/mL、0.03125 μmol/mL和0.0156255 μmol/mL的标准溶液，按照UA试剂盒说明书配制反应体系，混匀，37 ℃水浴反应30 min，用酶标仪在505 nm处测定吸光值（A）。以各个标准溶液的浓度为x轴，其对应的ΔA为y轴，绘制标准曲线如图2。

图2 尿酸标准曲线

2.3 MSQ2对酵母膏和氧嗪酸钾诱导小鼠高尿酸血症的影响

如图3所示，小鼠经灌胃酵母膏和注射氧嗪酸钾7 d后，模型组小鼠的血尿酸水平为120 mmol/L，与正常组小鼠相比上升了50%，差异性显著（P＜0.05）；与模型组（Model）相比，蔓三七提取物（MSQ2）低剂量组（L-dose）、中剂量组（M-dose）、高剂量组（H-dose）均显示出不同程度降低小鼠血尿酸水平（P＜0.05）。结果说明，蔓三七提取物（MSQ2）对酵母膏和氧嗪酸钾诱导联合诱导的高尿酸血症小鼠有显著的降低尿酸作用。

图3 蔓三七提取物（MSQ2）对高尿酸血症小鼠血清尿酸的影响

3 结论

氧嗪酸钾是一种竞争性尿酸酶抑制剂，可阻断肝脏尿酸酶的作用，并在啮齿类动物中产生尿酸，是适合啮齿类动物的高尿酸造模用药[4]。氧嗪酸钾不溶于水，采用腹腔注射氧嗪酸钾造模，采用合适的溶剂是成功的关键。0.5%羧甲基纤维素钠是脂溶性物质的常用助悬溶剂，可作为灌胃的辅料，不能作为腹腔注射溶液。因此，本文采用生理盐水进行溶解氧嗪酸钾，效果良好，可供借鉴使用。

本研究采用动物实验进行造模，通过腹腔注射酵母膏和氧嗪酸钾建立高尿酸血症模型，将造模成功的KM小鼠采用不同剂量的蔓三七提取物（MSQ2）灌胃治疗7 d后，蔓三七提取物（MSQ2）对酵母膏和氧嗪酸钾诱导联合诱导的高尿酸血症小鼠有显著的降低尿酸作用。后期的研究工作中，将检测血清中黄嘌呤氧化酶活性、SOD活性、GSH-Px活性、ROS活性，并开展蔓三七提取物（MSQ2）对尿酸钠诱导的大鼠急性痛风性关节炎模型的作用实验，检测蔓三七提取物（MSQ2）给药后对大鼠踝关节肿胀程度的影响，测定关节病理学变化，检测血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量的变化情况，为开发出具有市场竞争力的降低尿酸产品提供数据和理论支撑。